本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猫冠状病毒荧光ema检测引物组、试剂盒和检测方法。
背景技术：
猫冠状病毒(felinecoronavirus，fcov)：据统计，家庭饲养的猫有25％～40％为冠状病毒阳性，而在大型猫舍或是繁殖猫舍中，阳性率达到80％～100％。虽然感染后可能完全没有临床症状，但是可能会发生死亡率非常高的猫传染性腹膜炎，本病常发于四岁以下的年轻成猫，尤其常发于群聚饲养的猫群。目前，对猫传染性腹膜炎无有效的疫苗预防，也无有效的药物治疗。因此，对于fcov的管理与控制，准确的诊断是至关重要的。
目前，已有少数针对猫冠状病毒(fcov)核酸的检测方法，主要包括pcr技术和实时荧光定量pcr技术，对猫冠状病毒(fcov)核酸的检测灵敏度和特异性有了很大提升。但pcr技术和实时荧光定量pcr技术均需要配备价格高昂的pcr仪或实时荧光定量pcr仪，因此无法用于基层和现场检测，目前并未得到广泛应用。
因此，怎样能够满足基层检测用时少、技术和仪器要求低、操作简单方便的需求，成为业内急需解决的问题。
技术实现要素：
为解决以上技术问题，本发明提供一种猫冠状病毒荧光ema检测引物组、试剂盒及检测方法，特异性强、准确率高，操作简单、时间短、仪器要求低，能够快速、准确、低成本地检测猫冠状病毒。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：猫冠状病毒荧光ema检测引物组，所述猫冠状病毒荧光ema检测引物组包含上、下游引物和探针，所述上游引物序列是：5’-tcaaggtctggttctcagtctag-3’；所述下游引物序列是：5’-gttttcttccaggtgtgtttgt-3’；所述探针序列是5’-ttttcttccaggtgtgtttg/i6-famdt/t/idsp//ibhq1dt/taggtgt-3’c3spacer。其中：“i6-famdt”指6-fam(6-羧基荧光素)荧光标记的dt核苷酸，“idsp”指碱基缺失，“ibhq1dt”指带有bhq1淬灭基团标记的dt核苷酸，“c3spacer”指3’羟基封闭。
所述上、下游引物和探针是与权利要求1所述序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针是与权利要求1所述序列碱基互补的序列。
本发明还提供猫冠状病毒荧光ema检测试剂盒，所述试剂盒包括以下内容：
(1)复溶液；
(2)含引物的冻干酶管；所述引物包含上、下游引物和探针；
所述上游引物是：5’-tcaaggtctggttctcagtctag-3’；所述下游引物是：5’-gttttcttccaggtgtgtttgt-3’；所述探针是5’-ttttcttccaggtgtgtttg/i6-famdt/t/idsp//ibhq1dt/taggtgt-3’c3spacer；
(3)阳性对照品；
(4)阴性对照品。
其中，所述复溶液的成分如下：每30ml复溶液中含0.1-2m的mgac2840μl、0.1-2mph8.0的tris-ac3.00ml、0.1-2m的dtt150μl、无rnase水26.01ml。
优选的，所述复溶液的成分如下：每30ml复溶液中含1-2m的mgac2840μl、1-2mph8.0的tris-ac3.00ml、1-2m的dtt150μl、无rnase水26.01ml。
其中，所述含引物的冻干酶管的成分如下：每4ml冻干酶管中含有1000～3000ng/ul的单链dna结合蛋白178μl、10-100ng/ul的atp再生蛋白75μl、200-2000ng/ul的dna解旋酶259μl、100-1000ng/ul的dna聚合酶75μl、100-1000ng/ul的dna限制性内切酶200μl、10-300ng/ul的辅助蛋白30μl、50-500ng/ul的m-mlv逆转录酶400μl、500-5000ng/ul的rnase抑制剂10μl、10-100μm的上游引物5μl、10-100μm的下游引物5μl、10-100μm的探针15.5μl、1-10m的磷酸肌酸钠144μl、10-100mm的atp144μl、5-50mm的dntp62μl、0.1-2mph8.0的tris-ac21.57ul、海藻糖0.14g、kac0.02g、纯化水360μl。
优选的，所述含引物的冻干酶管的成分如下：每4ml冻干酶管中含有1500-2500ng/ul单链dna结合蛋白178μl、20-50ng/ulatp再生蛋白75μl、300-600ng/uldna解旋酶259μl、300-600ng/uldna聚合酶75μl、300-600ng/uldna限制性内切酶200μl、50-100ng/ul辅助蛋白30μl、100-200ng/ulm-mlv逆转录酶400μl、1000-2000ng/ulrnase抑制剂10μl、100μm上游引物5μl、100μm下游引物5μl、10μm探针15.5μl、1m磷酸肌酸钠144μl、80-100mmatp144μl、25mmdntp62μl、ph8.0的1-2mtris-ac21.57ul、海藻糖0.14g、kac0.02g、纯化水360μl。
其中，所述阴性对照品为无rnase水空白对照。
其中，所述阳性对照品为猫冠状伪病毒，浓度是1μg/ml。
本发明还提供一种猫冠状病毒的检测方法，所述检测方法采用权利要求3所述的猫冠状病毒荧光ema检测试剂盒，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的；所述检测方法包括以下步骤：
(1)提取样本中病毒rna；
(2)使用权利要求3所述的检测试剂盒，取10μl复溶液及10μl步骤(1)所得病毒rna，加入到含引物的冻干酶管中，充分混匀；
(3)将复溶的冻干酶管放入核酸荧光检测仪中，37-45℃扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次，采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；
(4)结果分析。
所述结果分析是：如果样本扫描荧光曲线为典型“s”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果。
优选的，所述样本可取自猫鼻、咽拭子、粪便、直肠拭子；或者，所述样本可取自猫胸、腹腔积液、脑脊液、房水、肾肉芽肿。
本发明使用常温核酸扩增技术，通过m-mlv逆转录酶、rnase抑制剂、dna解旋酶、单链dna结合蛋白、dna聚合酶等多个酶促反应，可在37-45℃恒温条件下，10-30分钟内使待检rna逆转录成edna，并将cdna扩增数百万倍，配合荧光检测技术，可以实现对待检rna的快速检定。
本发明的引物序列是这样得到的：从ncbi中下载猫冠状病毒基因组序列(序列号jq408980.1)，通过oligo7软件设计引物，以含目的序列的质粒为模板，通过凝胶电泳筛选最适引物。筛选标准：引物灵敏度至少到质粒6(10-4ng/μl)、副反应尽量少。筛选好引物后，以上下游引物中间的序列设计一条探针。
本发明的引物和探针的筛选步骤如下：
1：先用在线软件分析猫冠状病毒rna(jq408980.1)的结构，http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/rnawebsuite/rnafold.cgi，根据二级结构示意图，找出容易配对区域，见图3；
2：根据选取区域，按照以下规则进行引物设计，a)引物长度在20-30碱基之间；b)引物gc％在40％-60％之间；c)避免g或c多次重复；3：引物设计之后，进行扩增筛选，选取扩增特异性灵敏度最好的一对；
4：根据以上所选引物，在以上扩增片段中，设计不同的探针，对比不同探针，根据反应的灵敏度来筛选最好的一条探针；从而得到本发明所含引物对及探针：
上游引物：5’-tcaaggtctggttctcagtctag-3’；
下游引物：5’-gttttcttccaggtgtgtttgt-3’；
探针：5’-ttttcttccaggtgtgtttg/i6-famdt/t/idsp//ibhq1dt/taggtgt(3’c3spacer)。
本发明的ema(enzymesmediatedamplification，多酶介导的核酸扩增技术，即常温扩增技术)体系(包括复溶液、含引物的冻干酶管)通过比较酶加样量、引物浓度、反应温度、反应时间等确定最终反应体系。
本发明的有益效果包括：
1、本发明中逆转录与dna复制一步完成，核酸扩增条件为37℃到42℃，对温度要求低，对机器要求较低；
2、本发明的检测方法为一步法，反应时间短，可在30分钟内报告结果；
3、本发明以猫冠状病毒的序列为目的基因，筛选最佳引物，并配合以最适浓度及配比的酶和各种试剂，形成最优的实验反应体系，使本发明试剂盒具有检测能力上的优势与特点，不仅检测简单易行，而且具有较高的准确度、精密度、特异性以及可重复性。
本发明操作简单、时间短、仪器要求低，非常适合用于宠物传染性疾病的快速诊断。
附图说明
图1是阴、阳性样本测试结果示意图，其中，①具有典型“s”型，为阳性结果，②为水平线，不具有典型“s”型特征，为阴性结果。
图2是实施例2临床样本的检测结果图。
图3是是猫冠状病毒rna的容易配对区域。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明，所选配方为试剂盒的优选配方，但并不用来限制本发明的范围。
猫冠状病毒荧光ema检测引物组，所述猫冠状病毒荧光ema检测引物组包含上、下游引物和探针，所述上游引物是：5’-tcaaggtctggttctcagtctag-3’；所述下游引物是：5’-gttttcttccaggtgtgtttgt-3’；所述探针是5’-ttttcttccaggtgtgtttg/i6-famdt/t/idsp//ibhq1dt/taggtgt-3’c3spacer。其中：“i6-famdt”指6-fam(6-羧基荧光素)荧光标记的dt核苷酸，“idsp”指碱基缺失，“ibhq1dt”指带有bhq1淬灭基团标记的dt核苷酸，“c3spacer”指3’羟基封闭。
所述上、下游引物和探针可以是与权利要求1所述序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针是与权利要求1所述序列碱基互补的序列。
本发明还提供猫冠状病毒荧光ema检测试剂盒，所述试剂盒包括以下内容：
(1)复溶液；
(2)含引物的冻干酶管；所述引物包含上、下游引物和探针；
所述上游引物是：5’-tcaaggtctggttctcagtctag-3’；所述下游引物是：5’-gttttcttccaggtgtgtttgt-3’；所述探针是5’-ttttcttccaggtgtgtttg/i6-famdt/t/idsp//ibhq1dt/taggtgt-3’c3spacer；
(3)阳性对照品；
(4)阴性对照品。
其中，所述复溶液的成分如下：每30ml复溶液中含0.1-2m的mgac2840μl、0.1-2mph8.0的tris-ac3.00ml、0.1-2m的dtt150μl、无rnase水26.01ml。
其中，所述含引物的冻干酶管的成分如下：每4ml冻干酶管中含有1000～3000ng/ul的单链dna结合蛋白178μl、10-100ng/ul的atp再生蛋白75μl、200-2000ng/ul的dna解旋酶259μl、100-1000ng/ul的dna聚合酶75μl、100-1000ng/ul的dna限制性内切酶200μl、10-300ng/ul的辅助蛋白30μl、50-500ng/ul的m-mlv逆转录酶400μl、500-5000ng/ul的rnase抑制剂10μl、10-100μm的上游引物5μl、10-100μm的下游引物5μl、10-100μm的探针15.5μl、1-10m的磷酸肌酸钠144μl、10-100mm的atp144μl、5-50mm的dntp62μl、0.1-2mph8.0的tris-ac21.57ul、海藻糖0.14g、kac0.02g、纯化水360μl。
所述复溶液和含引物的冻干酶管具有以下的组分含量时，具有更好的检测效果：
优选的，所述复溶液的成分如下：每30ml复溶液中含1-2m的mgac2840μl、1-2mph8.0的tris-ac3.00ml、1-2m的dtt150μl、无rnase水26.01ml。
优选的，所述含引物的冻干酶管的成分如下：每4ml冻干酶管中含有1500-2500ng/ul单链dna结合蛋白178μl、20-50ng/ulatp再生蛋白75μl、300-600ng/uldna解旋酶259μl、300-600ng/uldna聚合酶75μl、300-600ng/uldna限制性内切酶200μl、50-100ng/ul辅助蛋白30μl、100-200ng/ulm-mlv逆转录酶400μl、1000-2000ng/ulrnase抑制剂10μl、100μm上游引物5μl、100μm下游引物5μl、10μm探针15.5μl、1m磷酸肌酸钠144μl、80-100mmatp144μl、25mmdntp62μl、ph8.0的1-2mtris-ac21.57ul、海藻糖0.14g、kac0.02g、纯化水360μl。
其中，所述阴性对照品为无rnase水空白对照。
其中，所述阳性对照品为猫冠状伪病毒，浓度是1μg/ml。
本发明还提供一种猫冠状病毒的检测方法，所述检测方法采用权利要求3所述的猫冠状病毒荧光ema检测试剂盒，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的；所述检测方法包括以下步骤：
(1)提取样本中病毒rna；
(2)使用权利要求3所述的检测试剂盒，取10μl复溶液及10μl步骤(1)所得病毒rna，加入到含引物的冻干酶管中，充分混匀；
(3)将复溶的冻干酶管放入核酸荧光检测仪中，37-45℃扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次，采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；
(4)结果分析：如果样本扫描荧光曲线为典型“s”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果。
其中，所述样本可取自猫鼻、咽拭子、粪便、直肠拭子；或者，所述样本可取自猫胸、腹腔积液、脑脊液、房水、肾肉芽肿。
实施例1，猫冠状病毒荧光ema检测
采用猫冠状病毒荧光ema检测试剂盒进行猫冠状病毒的检测。所述猫冠状病毒荧光ema检测试剂盒包括：
1、复溶液500μl；
复溶液每30ml含有：
2、含引物的冻干酶管48头份；
每4ml冻干混合液包含以下各组分：
其中，引物对及探针的序列如下：
上游引物：5’-tcaaggtctggttctcagtctag-3’；
下游引物：5’-gttttcttccaggtgtgtttgt-3’；
探针：5’-ttttcttccaggtgtgtttg/i6-famdt/t/idsp/
/ibhq1dt/taggtgt-3’c3spacer。
3、阴性对照品为无rnase水空白对照。
4、阳性对照品为猫冠状伪病毒，浓度是1μg/ml。
猫冠状病毒荧光ema检测步骤如下：
(1)提取样本中病毒rna；
(2)使用上述的检测试剂盒，取10μl复溶液及10μl步骤1提取的病毒rna，加入到含引物的冻干酶管中，充分混匀；
(3)将复溶的冻干酶管放入核酸荧光检测仪中，37-45℃扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次，采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；
(4)结果分析：如果样本扫描荧光曲线为典型“s”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果。
检测结果如图1所示，其中①具有典型“s”型，为阳性结果，②为水平线，不具有典型“s”型特征，为阴性结果。
实施例2：临床样本的检测：
采用猫冠状病毒荧光ema检测试剂盒进行猫冠状病毒临床样本的检测。所述猫冠状病毒荧光ema检测试剂盒包括：
1、复溶液500μl；
复溶液每30ml含有：
2、含引物的冻干酶管48头份；
每4ml冻干混合液包含以下各组分：
其中，引物对及探针的序列如下：
上游引物：5’-tcaaggtctggttctcagtctag-3’；
下游引物：5’-gttttcttccaggtgtgtttgt-3’；
探针：5’-ttttcttccaggtgtgtttg/i6-famdt/t/idsp/
/ibhq1dt/taggtgt-3’c3spacer。
3、阴性对照品为无rnase水空白对照。
4、阳性对照品为猫冠状伪病毒，浓度是1μg/ml。
猫冠状病毒荧光ema检测步骤如下：
(1)提取样本中病毒rna；
(2)使用上述的检测试剂盒，取10μl复溶液及10μl步骤1提取的病毒rna，加入到含引物的冻干酶管中，充分混匀；
(3)将复溶的冻干酶管放入核酸恒温荧光检测仪中，37-45℃扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次，采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；
(4)结果分析：如果样本扫描荧光曲线为典型“s”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果。
取临床样本11例疑似病例猫粪便、咽拭子，样本来源于某动物医院，采用猫冠状病毒荧光ema检测试剂盒进行猫冠状病毒的检测，结果见图2，图中7条曲线呈现典型“s”型曲线，判为阳性结果，而呈水平线的样本可以判为阴性结果。因此检测和分析结果是：检出fcov阳性样本7例、阴性样本4例。
同时用两个市售品牌的pcr法检测试剂盒做为对比例，本发明与这两个市售品牌的pcr法检测试剂盒检验一致率均为100％。证实本发明灵敏度与特异度与市售产品基本一致，但是在耗时及成本上，本发明更具有优势，且本发明更适合于现场处置。
实施例3，交叉反应检测：
用猫杯状病毒、猫瘟热病毒、猫疱疹病毒、犬温热病毒、犬细小病毒及狂犬疫苗核酸，以猫冠状病毒阳性样本为对照，进行本发明特异性的检测，结果显示除猫冠状病毒阳性样本为阳性结果外，其他样本均为阴性结果，证明本发明猫冠状病毒的检测与猫杯状病毒、猫瘟热病毒、猫疱疹病毒、犬温热病毒、犬细小病毒及狂犬疫苗核酸没有交叉反应。
本发明使用常温核酸扩增技术，通过m-mlv逆转录酶、rnase抑制剂、dna解旋酶、单链dna结合蛋白、dna聚合酶等多个酶促反应，可在37-45℃恒温条件下，10-30分钟内使待检rna逆转录成cdna，并将cdna扩增数百万倍，配合荧光检测技术，可以实现对待检rna的快速检定。
本发明以猫冠状病毒的序列为目的基因，筛选最佳引物，并配合以最适浓度及配比的酶和各种试剂，形成最优的实验反应体系，使本发明试剂盒具有检测能力上的优势与特点，不仅检测简单易行，而且具有较高的准确度、精密度、特异性以及可重复性。本发明操作简单、时间短、仪器要求低，非常适合用于宠物传染性疾病的快速诊断。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110>苏州点晶生物科技有限公司
<120>猫冠状病毒荧光ema检测引物组、试剂盒和检测方法
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