一种防霉芽孢杆菌菌株及其在粮食储藏中的应用的制作方法

本发明属于新菌种筛选技术及微生物技术领域，特别涉及一株抗霉菌的芽孢杆菌属菌株及其在粮食储藏中的防霉应用。

背景技术：

大米是我国南方地区主要粮食作物之一，然而由于受农户个体种植、贮藏方式，以及长江流域和华南地区高温高湿天气等诸多因素的影响，大米在仓储、运输和销售环节中受真菌毒素污染情况严重，极易发生霉变。

国内外在大米保鲜方法上主要从以下几个方面进行了研究：一是研究大米陈化的机理，来控制陈化提高大米的存放期，延缓大米在储藏过程中水分、蛋白质、淀粉和脂肪等的变化；二是通过杀死大米上附着的成虫、虫卵、细菌或破坏其生长环境，从而抑制生物生长繁殖，来延长大米的储藏期；三是将大米与虫卵、细菌隔离，使之失去营养来源来提高大米的储藏品质(吴艳丽,潘丽爱.大米保鲜及储藏技术的研究进展.粮食工程·技术,2013,10:59-62)。其中，对于杀灭或抑制大米上致病菌这一方面，目前市面上主要采取的措施是采用保鲜剂或化学熏蒸。尽管运用化学防腐剂是为目前最为经济有效的办法，但由于剂量超标、使用频繁等原因，其对土壤、水体等环境污染也日益严重。残留在粮食中的化学杀菌剂通过食物链可进一步影响到人体健康，带来一定食品安全问题。基于上述原因，寻找和开发能够代替化学防腐剂且安全无污染的大米保鲜方法是为当前农业发展的一个必然。

目前生物防霉剂已部分代替化学防腐剂被应用在肉类、果蔬等食品保鲜及加工中。但总体而言，目前对于大米等粮食的储藏保鲜方法主要是通过气调等环境控制或用化学熏蒸剂处理来控制微生物生长。芽孢杆菌是一种自然界中广泛存在的革兰氏阳性杆状细菌，其特征在于能够产生多种抑菌物质和酶类，具有较强的防腐作用，且分离培养容易，应用前景广。但目前，还未有将芽孢杆菌挥发性代谢产物应用到粮食防霉保鲜领域的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株抗霉菌芽孢杆菌属菌株及其应用方法，其挥发性代谢物可在粮食储藏过程中通过气调发挥防霉作用，是一种简单易行、高效环保的微生物处理方法，具有广阔的市场前景。

本发明公开了一种抗霉菌芽孢杆菌属菌株，所述菌株的分类命名为地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)byj7，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏编号：cgmccno.16705，保藏日期：2018年11月5日。

本发明还公开了一种抗霉菌芽孢杆菌属菌株的筛选方法，具体方法为：选用多区域分隔培养皿，隔板一侧加入马铃薯葡萄糖琼脂培养基pda，用于培养黄曲霉菌；另一侧加入tsa或lb培养基以培养芽孢杆菌。实验组挑取已经活化的芽孢杆菌涂布至培养皿上，涂布区域保持一致；空白对照组则不进行上述涂布操作，之后用竹签挑取少量黄曲霉菌孢子以点涂方式接种至培养皿pda培养基一侧区域的中心位置；接种完成、封口膜双层封口后，于25℃培养箱中倒置培养一周，且每隔24h测量各组黄曲霉菌菌斑直径，并计算抑菌率；选取抑菌率大于15％的菌株，以抑菌率为指标筛选出所述最佳抗霉菌芽孢杆菌属菌株。本发明的筛选方法具有普适性，能够推广到所有粮食防霉细菌的筛选,筛选得到的菌的发酵液可释放气体挥发物，该气体挥发物对霉菌抑制效果佳。本发明所述的地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)byj7是该方法筛选得到的其中一种所产气体挥发物抑制功效最好的菌株。

本发明还公开了一种地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)byj7的发酵液制备方法，其特征在于所述方法为：将活化后的地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)byj7以2％-10％(v/v)接种量接种于装有tsa或lb液体培养基的锥形瓶中，37℃、180rpm密闭培养过夜，即得到含有挥发性抗菌代谢物的芽孢杆菌发酵液。

本发明还公开了一种筛选最适合抗霉菌芽孢杆菌属菌株生长产气的培养基的方法。

培养基筛选方法为：选用多区域分隔培养皿，其中隔板一侧加入马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)，用于培养黄曲霉菌；另一侧加入待筛选培养基(nb培养基，tsa培养基，tsb-ye培养基)以培养芽孢杆菌。剩余处理步骤以及检测指标与上述筛选抗霉菌芽孢杆菌属菌株方法相同。

作为优选，所述芽孢杆菌属菌株培养基tsa培养基的配方为：15g胰蛋白胨，5g氯化钠，5g大豆蛋白胨，1.5％琼脂，1l去离子水。

本发明所述地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)byj7可以应用于制备粮食储藏熏蒸剂或保鲜剂，可以在粮食储藏中抑制黄曲霉、赭曲霉等霉菌的生长繁殖。

所述的粮食优选为大米。

本发明进一步公开了一种大米储藏方法：

1)对封闭仓储环境进行清洁和消毒，放入干燥清洁的大米；

2)使用所述地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)byj7的发酵液：稀释发酵液，使得菌浓度为10⁶-10⁹cfu/ml；

3)将大米与步骤2)中稀释后的发酵液在同一密闭空间进行熏蒸，稀释后的发酵液与储粮空间的体积比为0.5％-1％；保持60％-90％的相对湿度，置于20-30℃下保藏。

模拟大米储藏实验中，将大米经消毒处理后接种黄曲霉菌，同时利用地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)byj7挥发性代谢产物对其进行熏蒸处理，观察大米发霉情况并根据国标gb4789.2-2016测定大米中菌落总数。研究发现地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)byj7挥发性代谢产物对大米中的菌落总数有较明显的抑制作用，抑制率可达38％。

通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株，通过dna凝胶回收试剂盒(ge0101)，pclone007vectorkit试剂盒(tsv-007)步骤和pcr方法提取纯化并扩增该菌株的基因组dna，通过测定16srdna的序列来进行菌种鉴定。将该菌种所测得序列在genbank数据库中进行blast对比分析，在比对匹配度最高的结果中发现与地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)pb-wc09001的16srdna序列同源性最高。可确定菌种为地衣芽孢杆菌，命名为bacilluslicheniformisbyj7。该菌株的生物保藏信息为：中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号cgmccno.16705。

本发明的有益效果：

本发明所述地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)byj7及其挥发性代谢物具备一定抗菌能力。根据模拟大米储藏试验结果，地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)byj7挥发性代谢产物能够在粮食储藏过程中抑制或延缓黄曲霉菌等腐败菌的生长，从而起到防霉保鲜作用，保障储粮安全。

本发明所述芽孢杆菌本身抗逆性强，且抑菌谱广，可被应用于多种粮食仓储环境中，应用前景好、开发潜力强。

本发明所述芽孢杆菌为天然粮食防霉剂，可在实际生产中代替大量化学熏蒸剂被使用，对人体及环境兼具安全性。

附图说明

图1本发明所述菌株byj7对黄曲霉抑制效果图(培养120h和192h)。其中左侧为对照组，右侧为处理组。

图2本发明所述菌株byj7对黄曲霉抑菌效果曲线图。其中横坐标为培养时间，纵坐标为抑菌率。

图3本发明所述菌株byj7在不同培养基条件下对黄曲霉抑菌效果曲线图。其中横坐标为培养时间，纵坐标为抑菌率。

图4模拟大米储藏试验中所用挥发性有机物(volatileorganiccompounds，vocs)测试瓶装置图。

图5模拟大米储藏试验中菌落总数变化。其中横坐标为时间，纵坐标为大米中的菌落总数。

图6本发明所述菌株byj7的16srdna序列neighbor-joining系统发育树。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，本发明实施例中所用实验材料、试剂和仪器等均可通过市售获得，若未具体指明，则实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：本发明所述芽孢杆菌菌株及其挥发性代谢物对黄曲霉菌抑菌效果测定及与其他芽孢杆菌菌株比较

1.实验方法

选用多区域分隔培养皿，隔板一侧加入马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)，用于培养黄曲霉菌；另一侧加入lb培养基以培养芽孢杆菌。处理组挑取已经活化的芽孢杆菌涂布至培养皿上，涂布区域保持一致；空白对照组则不进行上述操作，即不在该区域平板培养基上接种。之后用竹签挑取少量黄曲霉菌孢子以点涂方式接种至培养皿pda培养基一侧区域的中心位置。

接种完成、封口膜双层封口后，于25℃培养箱中倒置培养一周，且每隔24h测量各组黄曲霉菌菌斑直径，并按下式计算抑菌率：

抑菌率(％)＝(空白对照组菌斑直径-实验组菌斑直径)/空白对照组菌斑直径×100％

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)：马铃薯(购自当地超市)去皮切块，称取200g，加入1000ml去离子水，煮沸30min，纱布过滤，加入葡萄糖20g，搅拌均匀，加蒸馏水补至1000ml，于121℃下高压蒸汽灭菌20min。

lb培养基配方：10g蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母膏，1.5％-2％琼脂，1l去离子水，于121℃下高压蒸汽灭菌20min。

实验中用到芽孢杆菌包括本发明所述菌株及其他三株芽孢杆菌菌株，以上菌株均由浙江大学生物系统工程与食品科学学院实验室提供。

2.实验结果及分析

实验数据结果(抑菌率)如表1所示，图2为本发明所述菌株及其挥发性代谢物对黄曲霉抑菌效果。与其他几株芽孢杆菌菌株相比，本发明所述菌株能够对黄曲霉菌达到更高的抑菌率，且抑菌率更为稳定。本发明所述芽孢杆菌菌株及其挥发性代谢物对黄曲霉抑菌效果良好且较为突出。

表1四种芽孢杆菌菌株对黄曲霉的抑菌率(％)

实施例2：本发明所述芽孢杆菌菌株最适培养基筛选

1.实验方法

实验中选用多区域分隔培养皿，其中隔板一侧加入马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)，用于培养黄曲霉菌；一侧加入待筛选的培养基培养本发明所述芽孢杆菌。处理组挑取已经活化的芽孢杆菌涂布至培养皿上，涂布范围是培养皿隔板一侧的全部区域；空白对照组则不进行上述操作，即不在该半面平板上接种。之后挑取少量黄曲霉菌孢子以点涂方式接种至培养皿pda培养基一侧区域的中心位置。

实验中用以培养本发明所述芽孢杆菌的待筛选的培养基为nb培养基、tsa培养基、tsb-ye培养基三种。

nb培养基配方：10g蛋白胨，3g牛肉膏，5g氯化钠，1.5％-2％琼脂，1l去离子水；高压蒸汽灭菌条件：121℃，20min。

tsa培养基配方：15g胰蛋白胨，5g氯化钠，5g大豆蛋白胨，1.5％琼脂，1l去离子水；高压蒸汽灭菌条件：121℃，20min。

tsb-ye培养基配方：15g胰蛋白胨，5g氯化钠，5g大豆蛋白胨，1.5％-2％琼脂，6.5g酵母浸膏，1l去离子水；高压蒸汽灭菌条件：121℃，20min。

接种完成、封口膜封口两层后，于25℃培养箱中倒置培养，且每隔24h测量各组黄曲霉菌菌斑直径，并按下式计算抑菌率：

抑菌率(％)＝(空白对照组菌斑直径-实验组菌斑直径)/空白对照组菌斑直径×100％

2.实验结果及分析

图3为本发明所述菌株在不同培养基培养下其挥发性代谢物对黄曲霉菌抑制效果。在三种不同培养基中，本发明所述芽孢杆菌在tsa培养基上对黄曲霉抑菌率与另两者相比明显要高，可以达到30％左右；而用nb与tsb-ye两种培养基培养从整体上看抑菌效果并不突出，也无太大区别。其原因可能是由于tsa培养基中氮源比另两者要充足且来源丰富，在一定程度上能够起到促进芽孢杆菌代谢产生挥发性代谢产物的作用，从而增强其对黄曲霉菌的抑菌效果。通过本实验可得tsa培养基是培养本发明所述芽孢杆菌的优选。

实施例3：模拟大米储藏试验

1.大米体内实验预处理

1.1实验材料、试剂与仪器

实验材料：东北大米(购自于当地超市)、黄曲霉、编号为byj7的芽孢杆菌、生理盐水、无菌水、离心管、竹签、塑料盒等。

实验试剂：0.3％次氯酸钠溶液、0.1％次氯酸钠溶液、tsa液体培养基。

实验仪器：vocs测试瓶、摇床、光学显微镜、烘箱、超净台等。

1.2实验方法

(1)vocs测试瓶装置的搭建

两只250ml上咀过滤瓶和一个二路直行活塞通过橡胶管连接起来。一只250ml上咀过滤瓶用橡胶塞密封(该瓶用作培养芽孢杆菌)，另一只250ml上咀过滤瓶用无菌培养封口膜密封(该瓶中放置受霉菌污染的大米)。该装置搭建好后需要进行高温高压灭菌。

(2)芽孢杆菌菌悬液制备

在平板上刮取少量芽孢杆菌byj7接种到盛有50ml液体tsa培养基的250ml锥形瓶中，放入37℃摇床中过夜培养。从过夜培养后的芽孢杆菌菌悬液中取1ml加入到vocs测试瓶装置的其中一个盛有50mltsa液体培养基的上咀过滤瓶中，将该vocs测试瓶装置放入摇床中在37℃下培养8h左右到达其对数期再进行实验用(对照组的液体tsa培养基不接种芽孢杆菌菌悬液)。

(3)霉菌孢子悬液制备

刮取黄曲霉霉菌孢子少量于预先加无菌水的5ml离心管中，振荡混匀，显微镜下进行孢子计数。得到的菌液浓度再稀释至10³cfu/ml，装在10ml离心管中备用。

(4)大米预处理

先用0.3％次氯酸钠溶液浸泡塑料盒10min，倒掉烘干。塑料盒内放入大米，用0.1％的次氯酸钠溶液没过大米表面浸泡30s。倒掉溶液后将塑料盒包上保鲜膜，置于烘箱内15min，使大米表面水分达近干状态，取出塑料盒。

(5)放置大米

称取100g上述处理过的大米加入另一只250ml上咀过滤瓶中，全部加入完毕后，在超净台内向每只装大米的瓶子内加入200μl上述黄曲霉孢子悬浮液(10³cfu/ml)。添加时尽量使孢子悬液在大米中分布均匀。

(6)培养

样品加入完毕将装置密封后，放入摇床中培养(温度：29℃；转速：150rpm)。之后分别取第四天(day4)和第八天(day8)的大米样品进行大米中霉菌总数的测定。

2.芽孢杆菌挥发性代谢产物对大米中菌落总数的影响

2.1实验方法

(1)称取5g样品置盛有45ml生理盐水的锥形瓶内，剧烈振荡5min，制成1:10的样品匀液。

(2)吸取1:10样品匀液400μl，沿管壁缓慢注于盛有3.6ml稀释液的无菌离心管中，混匀，制成1:100的样品匀液。

(3)按上述操作制各10倍系列稀释样品匀液。

(4)根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液，吸取200μl样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取200μl空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

(5)及时将15ml～20ml冷却至46℃的pda培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

(6)培养36-48h后计数。

2.2实验结果及分析

芽孢杆菌挥发性代谢产物对大米中菌落总数的影响如图5所示。

如图5所示，分别取上述培养第四天和第八天的大米进行菌落总数的测定。在第四天时，对照组和处理组中的菌落总数分别为5.2×10³cfu/g和3.2×10³cfu/g，抑菌率可达38％；在第八天时，对照组和实验组中的菌落总数分别为2×10⁵cfu/g和1.5×10⁵cfu/g，抑菌率为25％。说明芽孢杆菌挥发性代谢产物对大米霉变有一定的抑制作用，在储粮防霉中有一定的应用前景。

实施例4：本发明所述芽孢杆菌菌株的种属鉴定

1.实验方法

根据pclone007vectorkit试剂盒(tsv-007)步骤提取本发明所述菌株的总dna，以引物m13f-47和m13r-48扩增该菌的16srdna基因，回收扩增产物后进行测序，通过测定16srdna的序列来进行菌种鉴定。获得的序列结果在ncbi进行blast比对，从genbank的数据库中获得与该菌株16srdna同源的公认标准序列数据，使用mega软件计算序列相似性并采用邻位相连算法(neighbor-joining)作系统发育分析。

2.实施结果分析

本发明所述菌株经16srdna全序列测定鉴定，其序列结果如seqidno.1所示。

该菌株的16srdna在ncbi使用blast比对，发现是芽孢杆菌属(bacillussp.)并与其相似菌株16srdna序列构建16srdna系统发育树如图6所示，与地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)pb-wc09001的同源性最高，可确定本发明所述菌株为地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)，并命名为bacilluslicheniformisbyj7。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行适当改变和修饰，这些改变和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种防霉芽孢杆菌菌株及其在粮食储藏中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1556

<212>dna

<213>地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)

<400>1

tgaggctcgctgcaatcgcgtgtcgcccttagagtttgatcctggctcaggacgaacgct60

ggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggatagatgggagcttgctccctgatgtca120

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