生产羟基红景天苷的重组质粒和基因工程菌及其运用的制作方法

本发明涉及生物工程领域，具体涉及生产羟基红景天苷的重组质粒和基因工程菌及其运用。
背景技术：
：红景天在多国的医学史上都有使用记载，现代研究发现红景天能促进红细胞携氧的能力，对高原反应有着很好的疗效，同时对免疫系统有较好的调节作用。红景天具有降血糖、抗氧化应激、抑制血管平滑肌增殖等多种调节机制，可以有效治疗糖尿病血管并发症,用于人体各种系统疾病的治疗，充分体现的是其免疫调节、抗氧化应激的功能，作为一种中药适应原，对人体器官都具有一定的调节保护作用，因此红景天在各种疾病的治疗中也越来越受欢迎。红景天最有价值或者说潜力最大的一点是其具有抗肿瘤活性，研究表明红景天注射液能改善肿瘤患者体内的各种细胞免疫功能，可用于肺癌、乳腺癌等的治疗，可以有效抑制肿瘤细胞的增值和转移，中药红景天和其他抗肿瘤药物的联合用药能够发挥极高的疗效。目前，大部分红景天苷都是以红景天植物为原料，通过提取的方法获得，但是提取成本高，产量低。红景天植株本身的产量并不高，而且生长在高海拔的严寒地区，其产量受土地和气候等环境因素的影响，无法满足日益增长的需求。与此同时，传统的化学合成方法存在各种环境问题，例如合成过程中产生的废水等往往具有污染性且不易处理，不符合绿色发展的路线。随着合成生物学的发展与应用，利用基因工程筛选、构建相应的目标工程菌来对目标产物进行发酵，成为了新的合成以及发展衍生物研究热点。随着人们可持续发展意识和环保意识的提高，发酵法生产进入了人们的视线，引起了研究热潮。为响应绿色化工的发展要求，合成生物学的研究范围进一步扩大，技术逐渐成熟。许多药物分子的微生物合成已经实现，例如人参皂苷，灯盏花素等。目前全世界对红景天苷等药物的需求日益增长，为满足药物研究的需求，发展下游衍生物是很有必要的。羟基红景天苷(hydroxysolisade)是红景天苷的羟基化产物，化学式为c14h18o8是红景天苷的羟基衍生物，羟基红景天苷的发酵研究文献报道相对较少。综合已有研究红景天苷的文献来看，菌种研究方面，比较有应用前景的菌种包括基因改造的大肠杆菌和酵母菌。这两种菌都是通过混合酸发酵产能，但是酵母菌作为真核生物，代谢条件更接近天然植物，在代谢糖苷化酶上更具有优势。同时，酿酒酵母菌株本身培养条件简单，有代谢灵活，易于改造的特性。对工程酿酒酵母生产羟基红景天苷的途径研究表明，该途径的关键步骤是将酪氨酸催化成羟基酪醇(hydroxytyrosol)，产生的羟基酪醇随后被糖苷化酶(ugts)转化为羟基红景天苷。专利cn201711479443.3公开了一种生产酪醇和/或红景天苷的重组酿酒酵母菌株，外源基因包括arol基因、pcaas基因、atugt85a1基因、aro4*基因和aro7*基因。其将酪醇和/或红景天苷的生物合成途径中五个关键酶编码基因导入酿酒酵母中，使这些基因在酿酒酵母中进行过表达；调控从葡萄糖到酪氨酸的代谢流，来增强酪醇和红景天苷的生物合成，从而实现酿酒酵母由葡萄糖从头合成酪醇和红景天苷的途径构建。其合成过程需调控葡萄糖等底物，菌体会受到代谢产物的影响，并且未记载后续如何生成羟基红景天苷。综上，亟需一种生产羟基红景天苷的方法，实现由价格便宜的酪氨酸来合成稀有药物分子，拓宽红景天苷分子库的创新性方法。技术实现要素：本发明为了解决上述问题，本发明提供了一种生产羟基红景天苷的重组质粒组合物和基因工程菌及其运用。本发明目的之一在于提供一种用于生产羟基红景天苷的重组质粒，充分利用重组质粒生产重要药物分子的优势，拓宽红景天苷的分子库，构建新的羟基红景天苷的生物合成路径，具体技术方案如下：一种用于生产羟基红景天苷的重组质粒组合物，所述重组质粒组合物由ptax4511重组质粒和rrtg1068重组质粒组成，所述ptax4511重组质粒携带bvth基因和aas酶基因，所述rrtg1068重组质粒携带ugts基因；所述bvth基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述aas酶基因的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述ugts基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。本发明目的之二在于提供一种用于生产羟基红景天苷的工程菌，具体技术方案如下：上述方案中所述重组质粒组合物转入到酿酒酵母中得到的pvcl4869工程菌，所述pvcl4869工程菌包括bvth基因，aas酶基因和ugts基因。本发明目的之三在于提供上述pvcl4869工程菌在制备羟基红景天苷中的应用。进一步地，所述pvcl4869工程菌与l-酪氨酸发酵制备得到羟基红景天苷。本发明目的之四在于提供一种生产羟基红景天苷的方法，具体技术方案如下：一种生产羟基红景天苷的方法，具体步骤包括：(1)制备权利要求1所述的重组质粒组合物；(2)工程菌的制备：将步骤(1)所述的重组质粒组合物转入酿酒酵母菌中，得到pvcl4869工程菌；(3)羟基红景天苷的的制备：将所述pvcl4869工程菌与l-酪氨酸发酵得到羟基红景天苷。进一步地，步骤(1)的具体步骤包括：1)设计并选定引物，2)纯化pcr产物，连接ptrc99a载体，分别得到ptax4511重组质粒和rrtg1068重组质粒。进一步地，步骤1)中所述设计引物为：lys0x-f:5'-catgccatggatgacaatgttgactttgctgaat-3'lys0x-r:5'-cgggtaccttagatcttcacctggtactccttg-3'；gcd-f:5'-cggggtaccatggcaattaacaatacaggctcgc-3'gcd-r:5'-cgagctcttacttcacatcatccggcagcgca-3'；dpka-f:5'-cgagctcagaggaattcaccatgtccgcacc-3'dpka-r:5'-tgctctagagcctcagccaagcagctctttcaggc-3’；lysq-f:5'-tgctctagaatggtttccgaactaaaaccacag-3'lysq-r:5'-cccaagcttttatttcttatcgttctgcgggaac-3'。作为优选的，制备所述ptax4511重组质粒选取的引物为：dpka-f:5'-cgagctcagaggaattcaccatgtccgcacc-3'dpka-r:5'-tgctctagagcctcagccaagcagctctttcaggc-3’；制备所述rrtg1068重组质粒选取的引物为：lysq-f:5'-tgctctagaatggtttccgaactaaaaccacag-3'lysq-r:5'-cccaagcttttatttcttatcgttctgcgggaac-3'。进一步地，步骤(2)中所述酿酒酵母菌为nvsl4869工程菌。进一步地，步骤(3)中所述l-酪氨酸浓度为6g/l。进一步地，步骤(3)中所述发酵条件为：发酵温度30℃，ph＝6，发酵时间为120小时。通过上述发酵条件的优化，使得产物产量提高了近11.5％，提升明显，其提升效果超出预料之外。本发明将甜菜酪氨酸羟化酶bvth、aas酶基因和糖苷化酶ugts基因分别克隆到质粒载体ptrc99a上，获得重组质粒ptax4511与rrtg1068，再将重组后的质粒转入工程菌nvsl4869中，通过甜菜酪氨酸羟化酶bvth、aas酶基因和糖苷化酶ugts基因的过量表达使酿酒酵母获得生产目标酶的能力从而达到生产羟基红景天苷的目的。本发明的有益之处在于：(1)本发明的菌株和重组质粒能够在不影响酿酒酵母自身生存的条件下，利用酪氨酸为底物生产重要药物分子红景天苷的下游衍生物---羟基红景天苷，从而拓宽红景天苷在药理学和医学上的应用，进一步探索重要药物分子的微生物合成路径。重组质粒构建的工程菌在利用l-酪氨酸为底物合成羟基红景天苷的过程中，菌体自身的生长几乎未受到代谢产物的影响。(2)通过发酵条件的优化控制，使得产物产量提高了近11.5％，提升明显。lc-ms数据证明了本方法构建的羟基红景天苷生物合成路径能够实现产物的生产，实现由价格便宜的酪氨酸来合成稀有药物分子，拓宽红景天苷分子库的创新性方法。附图说明图1为本发明羟基红景天苷的生产路径示意图图2为本发明的两个重组质粒的构建示意图图3为本发明的工程菌与普通菌生长曲线对比图图4为不同浓度酪氨酸作为底物的羟基红景天苷产量对比图图5为不同发酵时间下羟基红景天苷产量和酪氨酸残余量曲线图图6为不同ph对羟基红景天苷的产量影响图7为本发明的发酵条件优化前后羟基红景天苷的产量变化具体实施方式下面通过实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的结构思路、使用范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例合成羟基红景天苷羟基红景天苷的合成路径如图1所示，主要分为下述七大步骤：1、培养基的配制lb培养基：每升水中含有5g酵母粉，10g胰蛋白胨和10gnacl。固体培养基为液体培养基中加入1.5％的琼脂粉。为了增加培养基的选择性，氨苄青霉素(amp)和卡那霉素(kan)的使用浓度是100μg/ml。酵母ypd培养基：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖。酵母固体筛选培养基：培养基固体粉末sd(购于coolaberscience)，另加入2％的琼脂粉。2、重组质粒的制备首先设计引物:lys0x-f:5'-catgccatggatgacaatgttgactttgctgaat-3'；lys0x-r:5'-cgggtaccttagatcttcacctggtactccttg-3'；gcd-f:5'-cggggtaccatggcaattaacaatacaggctcgc-3'；gcd-r:5'-cgagctcttacttcacatcatccggcagcgca-3'；dpka-f:5'-cgagctcagaggaattcaccatgtccgcacc-3'；dpka-r:5'-tgctctagagcctcagccaagcagctctttcaggc-3’；lysq-f:5'-tgctctagaatggtttccgaactaaaaccacag-3'；lysq-r:5'-cccaagcttttatttcttatcgttctgcgggaac-3'。其中，制备所述ptax4511重组质粒选取的引物为：dpka-f:5'-cgagctcagaggaattcaccatgtccgcacc-3'dpka-r:5'-tgctctagagcctcagccaagcagctctttcaggc-3’；制备所述rrtg1068重组质粒选取的引物为：lysq-f:5'-tgctctagaatggtttccgaactaaaaccacag-3'lysq-r:5'-cccaagcttttatttcttatcgttctgcgggaac-3'。纯化pcr产物,连接到ptrc99a载体,得到所述重组质粒ptax4511和rrtg1068，构建示意图如图2所示。(1)重组质粒ptax4511的酶切分析用碱裂解法提取质粒dna。取30μl质粒dna，用ncoi和kpni双酶切。混合均匀，稍稍离心使溶液聚集到管底。37℃，反应3小时。酶切反应体积如下：ddh2o28μl质粒空载体15μl10×cusmartbuffer5μl限制酶kpni1μl限制酶saci1μl总体积50μl酶切完毕后上样电泳检验确认。(2)重组质粒rrtg1068的酶切分析用碱裂解法提取质粒dna。取30μl质粒dna，用ncoi和kpni双酶切。混合均匀，稍稍离心使溶液聚集到管底。37℃，反应3小时。酶切反应体积如下：ddh2o28μl质粒空载体15μl10×cusmartbuffer5μl限制酶kpni1μl限制酶saci1μl总体积50μl酶切完毕后上样电泳检验确认。(3)重组质粒ptax4511的构建酶切反应37℃进行3小时后，电泳检验酶切程度。用dna回收试剂盒回收酶切后的质粒。使用dpni进行末端去磷酸化。反应按如下配比组成：酶切回收的质粒44μl10×cusmartbuffer5μldpni1μl总体积50μl以上成分混合后在37℃反应30分钟。目的dna片段与处理好的ptrc99a载体按如下方法混和后进行连接反应。目的基因与载体的摩尔数之比约1:3。依次将酪氨酸羟化酶bvth、aas酶基因链接，连接反应在22℃进行1小时后用于转化反应。目的dna片段的bvth基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。(4)重组质粒rrtg1068的构建酶切反应37℃进行3小时后，电泳检验酶切程度。用dna回收试剂盒回收酶切后的质粒。使用dpni进行末端去磷酸化。反应按如下配比组成：酶切回收的质粒44μl10×cusmartbuffer5μldpni1μl总体积50μl以上成分混合后在37℃反应30分钟。目的dna片段与处理好的ptrc99a载体按如下方法混和后进行连接反应。目的基因与载体的摩尔数之比约1:3。ptrc99a载体28μl目的dna片段15μlt410×dnaligasebuffer5μlt4dnaligase1μl总体积50μl连接反应在22℃进行1小时后用于转化反应。目的dna片段的ugts基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。3、dna连接产物的转化反应与阳性克隆筛选感受态细胞用cacl2法制备。选取大肠杆菌bl21(de3)制成感受态细胞，用热激法进行转化反应，热击出反应条件是42℃热击45秒。热击后加入500ul的lb培养基中【lb培养基的成分：(每1000ml)胰蛋白胨:10g，酵母提取物：5g，nacl10g，ph7.0-7.2】，37℃活化1小时后涂于含100μg/ml氨苄的lb平板上37℃过夜培养。挑取单菌落培养后碱液裂解法小量提取质粒，用ncoi和kpni双酶切分析。结果表明用bl21(de3)为宿主菌得到了阳性克隆。克隆所选用的方法是双酶切，这样克隆方向确定，保证了克隆基因的读码框方向正确。4、转化(1)取100μl冰上融化的invsc1感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2μl，carrierdna(98℃，5min，快速冰浴，重复一次)10μl，peg/liac500μl并吸打几次混匀，30℃水浴30min(15min时翻转6-8次混匀)。(2)将管放42℃水浴15min(7.5min时翻转6-8次混匀)。(3)5000rpm离心40s弃上清，ddh2o400μl重悬，离心30s弃上清；(4)ddh2o50μl重悬，涂质粒筛选用，29℃培养48-96h.取100μl菌液均匀涂布在含有终浓度为100μg/ml的ampicillin平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至20μllb培养基中混匀，直接取1μl作为pcr模板。将pcr阳性菌落的剩余菌液接种至含有适当抗生素的lb培养基中培养过夜，提取质粒做后续的鉴定。5、重组菌的生长特征及稳定性分析原始菌不具有抗性，构建好的重组质粒ptax4511带上有卡那霉素和组氨酸抗性基因而重组质粒rrtg1068则带有尿嘧啶与氨苄抗性基因。本基因工程菌能在尿嘧啶和组氨酸双抗性的筛选平板上正常生长，表明重组质粒已经转入原始菌株中。挑取30个这样的菌落接种于尿嘧啶和组氨酸双抗性的筛选平板上，在该平板上没有质粒的菌则不能生长。结果经过24h的培养，平板上长出了26个菌落，说明该菌在没有任何选择压力的条件下仍然十分稳定，稳定性达87％左右。6、重组菌pvcl4869的生长速率挑取平板培养的pvcl4869单菌落，接入20ml的加有氨苄终浓度为100μg/ml的ypd培养基中。30℃，250转/分培养12小时后，再按1％的接种量将其接入200ml的加有100μg/ml氨苄的ypd培养基，培养12小时，接种于发酵罐中，每隔6小时取样测定菌体的od值，如图3。可以看出在10h后，菌体正处于对数增长期，菌体的生长速率很快，菌体生物量增多，30h后菌的od值达到最大值150。7、发酵条件的优化为探索最佳发酵条件，探索了发酵温度、ph、底物浓度对发酵羟基红景天苷的产量的影响，如图4-6，优化时采用浓度梯度：1，2，4，6，8g/l的底物浓度；5，6，7，8的ph梯度，发酵时间以24-120h的范围内，每隔24h取样检测一次；均采用购于ccoolaber的m9培养基进行发酵。优化前后条件如下表：得到现有条件下的最佳发酵条件为温度30℃，ph＝6，发酵时间120h，在采用底物l-酪氨酸的浓度为6g/l时，如图7所示，相比优化前的产量5.12g/l，优化后的产量上升到5.71g/l，增长到95.2％，提高了近11.5％，其提升效果超出预料之外。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>重庆大学<120>生产羟基红景天苷的重组质粒和基因工程菌及其运用<130>2020.12.08<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1506<212>dna<213>artificialsequence<400>1atggacaacacgacgttagcattgattctatcatcattgttcgtctgtttccagttgata60aggtcatttatcaatcatgctaagaaaagtaataagttaccaccggggccaaaaagaatg120ccaatttttggtaatatatttgacctaggagaaaaacctcacagaagtttcgcgaacctg180gcaaagatccacggaccgttggtttctctacagctaggctccgtcacaactgttgtagta240agctccgctgacgttgctaaagagatgtttttgaaaaacgatcaagccttagccaacaga300acaatccccgattcagtgagggcgggagaccacgacaaattgagcatgtcatggttacca360gtatccgctaagtggaggaatttaagaaagattagtgcagtacaattgctgtctacccaa420cgtttagatgctagtcaagcacataggcaatcaaaagttcaacagttgctggagtacgtg480cacgattgctccaagaagggacagccagtggatattggaagagccgcatttacgacatct540ttgaacttgctatcaaacaccttcttctctgttgaactagcctcacacgaaagctccgcg600agccaggaattcaaacaattgatgtggaatatcatggaagagatcggtagacctaattac660gcagacttctttcccatccttggctacctggacccattcggcattagaaggaggttggca720ggctacttcgaccaattaatcgcggtgtttcaggatataataggagaaagacaaaagata780aggtccgctaatttaagtggagggaaacagaccaccaatgacatacttgacacgctgtta840aatctttacgacgaaaaggagttgtctatgggggaaatcaaccacttgttagtggatatt900tttgacgccggaacagatacgaccgctagtacgctagaatgggcaatggcggagctggta960aaaaatccggacatgatggtgaaggttcaagatgagattgagcaagctattggaaaaggt1020tgcagcatggtccaggaaagcgatatttcaaaacttccatacttgcaggctattatcaaa1080gaaactcttcgtttgcatccacccactgttttcctactacccaggaaagcagatgccgat1140gtagagctttacggttacgtggtccctaaaaatgctcaggttctggtgaatttgtgggcg1200attggacgtgaccccaaggtttggaaaaaccccgaggtattctcccccgaacgtttctta1260gaaagcaatatcgattacaagggacgtgactttgaattgcttccgtttggggcgggtagg1320aggatatgtcccgggctaacacttgcctataggatgctaaaccttatgatggctaacttt1380cttcacagttacgactggaagctggaggatgggatgcaccctaaggacctggacatggac1440gaaaaattcggaattactcttcaaaaagtcaaacccttgcaggtaatcccggtcccaagg1500aagtaa1506<210>2<211>1496<212>dna<213>artificialsequence<400>2atggatatcgaacaatttaggaaagcaggctatcaagccattgatcgcatatgcgattac60tactattctttgcaaaattcaactgttatgtctaaggttgagcctggatatttaaggcag120cacattcctttggaagcacccgaagagggtgaagactttcaaatcattgcagacgattac180cagaaatttatcgtaccaggtttaacgcattggcagcatccttctttctttgcctacttc240cctacggcatgcacattcgaggggattttgggagatttgtatgcatcaagcacttgcaac300cctggtttcaattggttggcgagtcctgcttgcacagagttagaggcaattgttatggat360tgggccgccaatctccttgggttatcatcagccttcaagaattcctcaggaattggcggt420ggggcaattcaaacaacagcgtcagactcagtcctcattacggttgtcgccgctcgatcc480atgtaccaacgtaaccatccagatgtaaaaatggaggatctcgttatatacacaactaca540caaacacattctctgggcgccaaagccggtatcgttcttggactacaagttcgctcgatc600gaggtcctcgcagaagaaaaatacgctttgagaggtcaagcccttcgtgacgcgttagaa660gaagaccgaaaactaggacgcaagcctttcatattgattgccaccgtcggatcgacttct720tcaggagctgtggacaacttaatggaaatccatcaaatatcaaaggaacaacctgaccta780tgggttcatgttgacgctgcttgggctggcgttgccctgtcctgcccggaaactcgcaaa840aatttatatctagaggatataaatgcctttgttcattcgttctgtaccaacttccacaag900tggggacttgttaattttgactgctctgccctttgggtccgagatcgcaaatatcttact960gatgctttggacatcactcctgccttcttacggacaaaacaaggagatgctggcacagtt1020attgactaccgaaactggcatttggggttgggtcgacgattccgttccttaaaaatgtgg1080tttgttttgagaggatttggcgcagagggtttccgcatgtacatccgacgatgcatagat1140ctgaaccagaaattcgcacaactcgttcgcgattctgaggagttgtctttggttaccgac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