成，总反应液体积为 25 4 1;正向外围引物为：5'-176(^6(：1"^〇六6611'0^6-3';
[0043] 反向外围引物为：5，-GAGGAGCCAGCAAGACAGA-3，；
[0044] 两条探针的序列分别为：
[0045] 正向5'端Biotin标记探针
[0046] 5' -Biotin-GTCCCCAGCAGAGCTGCTGAG-3，；
[0047] 反向3'端Fitc标记探针
[0048] 5， -Fitc-GGGAAGAAGACAGAGTTCACAG-3';
[0049] 两条扩增交叉引物分别为：
[0050] 扩增正向引物：
[0051] 5' -AGGGAATCCTTGGCCCAGATGTAAGCAGCGGCAGCAAC-3' ；扩增反向引物：
[0052] 5r -TGGCCTTCAGCCACTTCACCTCAGGGATCCTCTCCATGC-3 r ；
[0053] 所述的 IXThermol buffer 组成为：20mM 的 Tris-HClUOmM 的 KClUOmM 的 (NH4)2S04、2mM 的 MgSO4以及质量浓度为 0· 1% 的 Triton X-100, pH 8. 8。
[0054] 所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。
[0055] c)阳性对照：含有长189bp的新布尼亚病毒S片段基因序列，序列如下：
[0056] TTGCTGCTTACAGGTTTCTGTAAGCAGCAGCAGCAACCTCA GCAGCTCTGCTGGGGACCCCATCTGGG CCAAGGATCCCCTTGGCCTTCAGCCACTTCACCCGAACATCATTGGGAAAGAAGACAGAGTTCACAGCAGCATGGAG AGGATCCCTGAAGGAGTTGTAAACCTCTGTCTTGCTGGCTCCTC。
[0057] 阳性对照按如下步骤制备：
[0058] 以包含扩增区域的新布尼亚病毒S基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR 扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物 通过T-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽 提的质粒测A 28tl定量并稀释至10个拷贝/ μ 1，-20°C保存。
[0059] d)阴性对照：无菌双蒸水。
[0060] 实施例2用本发明试剂盒检测新布尼亚病毒核酸的具体方法
[0061] a)用新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒中RNA提取液从待检测的标本中提取 RNA (疑似病例或蜱虫标本提取核酸需在生物安全实验室进行）作为标本RNA。
[0062] b)取标本RNA作为模板，加入到装有新布尼亚病毒恒温扩增反应液的PCR管中，其 中标本RNA 5 μ 1，反应液20 μ 1，60°C扩增反应35分钟；阳性和阴性对照PCR管中分别加入 阳性模板和阴性模板。
[0063] c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置（杭州优思达生物技术公 司3号装置）中进行检测，2分钟以后判读结果。当样本中含有新布尼亚病毒核酸时，试纸 条的检测线上呈阳性。
[0064] 反复重复实验3次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测 结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的试剂盒来检测重复性 好，且对样本的检测仅仅需要1个小时左右就能完成，大大缩短检测时间。
[0065] 实施例3用本发明试剂盒检测新布尼亚病毒的特异性
[0066] 按照实施例2的方法检测西尼罗病毒核酸RNA、基孔肯雅热病毒RNA、登革热病毒 核酸RNA，其结果如图2。从图2测试结果可见，用本发明试剂盒检测新布尼亚病毒核酸具 有很强的特异性。
[0067] 实施例4用本发明试剂盒检测新布尼亚病毒核酸的灵敏度
[0068] 对新布尼亚病毒的S基因质粒DNA进行定量，分别稀释至浓度为IO4拷贝/微升、 IO3拷贝/微升、10 2拷贝/微升、10 1拷贝/微升，采用实施例2中所述方法来确定本发明试 剂盒用于检测新布尼亚病毒核酸的灵敏度。结果如图3所示，图2中1-4分别表示空白对 照、IO 1拷贝/微升、10 2拷贝/微升、10 3拷贝/微升、10 4拷贝/微升，可以发现该试剂盒可 在每个反应体系中检出100个拷贝，具有很高的灵敏度，可以满足快速检测新布尼亚病毒 核酸的要求。
【主权项】
1. 一种新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒组成包括： (1) RNA提取试剂； (2) 恒温PCR扩增反应液：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条扩增交叉引 物、IX Thermol Buffer，MgS04, dNTPs溶液，Bst DNA聚合酶，AMV逆转录酶和无菌双蒸水； 所述正向外围引物为：5' -TTGCTGCTTACAGGTTCCTG-3'; 反向外围引物为：5' -GAGGAGCCAGCAAGACAGA-3'; 所述两条探针的序列分别为： 正向 5' 端 Biotin 标记探针 5' -Biotin-GTCCCCAGCAGAGCTGCTGAG-3'; 反向 3 ' 端 Fitc 标记探针 5' -Fitc-GGGAAGAAGACAGAGTTCACAG-3'; 所述两条扩增交叉引物分别为： 扩增正向引物： 5r -AGGGAATCCTTGGCCCAGATGTAAGCAGCGGCAGCAAC-3r ； 扩增反向引物： 5r -TGGCCTTCAGCCACTTCACCTCAGGGATCCTCTCCATGC-3r ； (3) 阳性对照：含有新布尼亚病毒的S基因片段的DNA质粒； (4) 阴性对照：无菌双蒸水。
2. 如权利要求1所述新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述I X Thermol Buffer 组成为：20mM 的 Tris-HClUOmM 的 KClUOmM 的（NH4) 2S04、2mM 的 MgSO4以及质量浓 度为 〇· 1%的 Triton X-100, pH 8. 8〇
3. 如权利要求1所述新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照 为含有长189bp的新布尼亚病毒S片段的基因序列，所述基因序列的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示。
4. 如权利要求1所述新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照按 如下步骤制备： 以包含扩增区域的新布尼亚病毒S基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增 获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过 T-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质 粒测A28tl定量并稀释至10个拷贝/ μ 1，获得阳性对照，-20°C保存。
5. 如权利要求1所述新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述恒温PCR 扩增反应液组成为：两条外围引物各自15pmol，两条探针各自20pmol，两条交叉引物各自 30pmol，IXThermol buffer，MgSO4为 6mmol，dNTPs 溶液各 0.4mmol，Bst DNA 聚合酶 8U， AMV逆转录酶5U，无菌双蒸水组成补足至25 μ 1。
6. -种权利要求1所述新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒的检测方法，其特征在于所 述检测方法为： a) 用试剂盒中RNA提取试剂从待检测的标本中提取RNA ; b) 将步骤a)提取得到的RNA作为模板，加入到装有恒温PCR扩增反应液的PCR管中， 在60°C下扩增反应35分钟；将阳性对照加入到阳性对照PCR管中，将阴性对照加入阴性对 照PCR管中，所述阳性对照为含有新布尼亚病毒的S基因片段的质粒，所述阴性对照为无菌 双蒸水； C)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置中进行检测，2分钟以后判读 结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有新布尼亚病毒核酸。
【专利摘要】本发明公开了一种新布尼亚病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包含RNA提取试剂、恒温PCR扩增反应液、阳性对照和阴性对照；本发明的检测试剂盒特异性好、灵敏度高；从病毒RNA逆转录到链置换扩增全部恒定同一温度，恒温扩增仅需35分钟，核酸试纸条检测结果需2分钟左右，全程从接受样品到获得结果整个检测过程仅需1小时左右，且整个反应过程只需一个恒温仪器，特别适合新布尼亚病毒感染或蜱虫等媒介监测的快速检测使用。
【IPC分类】C12Q1-70, C12R1-93, C12Q1-68
【公开号】CN104561375
【申请号】CN201410795993
【发明人】蒋健敏, 卢亦愚, 徐昌平, 冯燕, 陈寅, 高见
【申请人】浙江省疾病预防控制中心
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月18日