一种用于检测志贺毒素的引物、探针和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及试剂盒领域，特别涉及一种用于检测志贺毒素的引物、探针和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 志贺毒素（ShigaToxin，Stx)是一种重要的毒力致病因子，其主要由痢疾志贺菌 产生，志贺毒素与中毒性腹泻出血性肠炎溶血性尿毒症等严重并发症的发生密切相关。某 些大肠杆菌在其漫长的进化过程中获得志贺毒素，从而使其具有了致病性，得到产志贺毒 素型大肠杆菌（ShigaToxin-producingEscherichiacoli,STEC) 〇
[0003] 现有技术中采用ELISA试剂盒检测STEC，并以STEC携带的志贺毒素的编码产物作 为判断标准，但现有的ELISA试剂盒具有较高的敏感性，使得在检测过程中受到多种因素 的影响，降低了检测的准确性。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中ELISA试剂盒检测STEC准确性低的问题，本发明实施例提供 了一种检测志贺毒素的引物、探针和试剂盒。所述技术方案如下：
[0005] 一方面，本发明实施例提供了一种用于检测志贺毒素的引物和探针，所述引物和 探针包括：用于检测志贺毒素的正向引物、用于检测志贺毒素的反向引物和用于检测志贺 毒素的探针，其中，
[0006] 所述用于检测志贺毒素的正向引物如序列表中SEQIDNO. 1所示；
[0007] 所述用于检测志贺毒素的反向引物如序列表中SEQIDNO. 2所示；
[0008] 所述用于检测志贺毒素的探针如序列表中SEQIDNO. 3所示；
[0009] 所述探针的5'端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5,所述 探针的 3' 端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或DABCYL。
[0010] 另一方面，本发明实施例提供了一种用于检测志贺毒素的试剂盒，所述试剂盒包 括上述的引物和探针。
[0011] 具体地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控 品、阴性质控品和工作标准品。
[0012] 具体地，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为0. 03-0. 3%聚乙二醇辛基苯基醚、 终浓度为〇. 04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH值为8. 3的终浓度为0. 01-0. 1M的三 (羟甲基）氨基甲烷。
[0013] 具体地，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0. 01U/ yL?0. 05U/yL的Taq酶、终浓度为0. 2?0. 6mM的dNTPs、10XPCR缓冲液和终浓度为 1. 5?5.OmM的含Mg离子的溶液。
[0014] 具体地，所述临界阳性质控品包括含浓度为1.OX104拷贝/mL的志贺毒素I型基 因片段的溶液。
[0015] 具体地，所述正向引物和所述反向引物的终浓度均为0. 05-0. 9yM，所述探针的终 浓度为 0.05-0. 9yM。
[0016] 具体地，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作 标准品4,其中，
[0017] 所述工作标准品1为含有1.OX107拷贝/mL的志贺毒素基因的非传染性DNA片 段；
[0018] 所述工作标准品2为含有1.OX106拷贝/mL的志贺毒素基因的非传染性DNA片 段；
[0019] 所述工作标准品3为含有1.OX105拷贝/mL的志贺毒素基因的非传染性DNA片 段；
[0020] 所述工作标准品4为含有1.OX104拷贝/mL的志贺毒素基因的非传染性DNA片 段。
[0021] 具体地，所述阳性质控品包括含浓度为1.ox106拷贝/mL的志贺毒素基因片段的 溶液。
[0022] 具体地，所述阴性质控品为浓度0. 8%的生理盐水。
[0023] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的用于检测 志贺毒素的引物和探针具有灵敏度高的特性，使得本发明实施例提供的用于检测志贺毒素 的试剂盒具有灵敏度高的特性，采用仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，其检测 结果可靠，提高了检测的灵敏度，即使仅存在单拷贝的目的片段该试剂盒也可以进行有效 的检测；检测速度快，整个检测过程共仅需2?3小时。
【附图说明】
[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他 的附图。
[0025]图1是本发明实施例2提供的荧光扩增曲线图；
[0026]图2是本发明实施例3提供的荧光扩增曲线图；
[0027] 图3是本发明实施例4提供的荧光扩增曲线图；
[0028] 图4是本发明实施例5提供的标准曲线的荧光扩增曲线图；
[0029] 图5是本发明实施例5提供的荧光扩增曲线图；
[0030]图6是本发明实施例5提供的由图4得到的标准曲线图，图6横坐标为Log StartingQuantitycopynumber，纵坐标为ThresholdCycle。
[0031]图中：Cycles为循环数，RFU为焚光值，LogStartingQuantitycopynumber为 志贺毒素起始浓度的对数值，Ct(ThresholdCycle)值为循环数；la-实施例2中样品1， 4a-实施例2中样品4, 5a-实施例2中样品5,6a-实施例2中样品6, 7a-实施例2中样品 7〇
【具体实施方式】
[0032] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式 作进一步地详细描述。以下实施例中所用试剂和探针主要购自宝生物工程（大连）有限公 司。
[0033] 实施例1.一种用于志贺毒素核酸定量检测的引物和荧光探针
[0034] 本发明实施例提供了一种用于检测志贺毒素的引物和探针，引物和探针包括：用 于检测志贺毒素的正向引物、用于检测志贺毒素的反向引物和用于检测志贺毒素的探针， 其中，
[0035] 用于检测志贺毒素的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示；
[0036] 用于检测志贺毒素的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示；
[0037] 用于检测志贺毒素的探针如序列表中SEQ ID NO. 3所示；
[0038] 探针的5'端连接有荧光基团？411、册乂、了￡1\1(^、￥1(：、1?(?、〇73或〇75，探针的3' 端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
[0039] 在本发明实施例中，探针的荧光报告基团为FAM，FAM的激发波长为485nm，接收波 长为527nm;淬灭基团为Eclipse。纯化方式可选自：HAP、PAGE和HPLC纯化方式，具体地引 物和探针如下表：
[0040] 表1.志贺毒素引物和探针
[0041]
【主权项】
1. 一种用于检测志贺毒素的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：用于检 测志贺毒素的正向引物、用于检测志贺毒素的反向引物和用于检测志贺毒素的探针，其中， 所述用于检测志贺毒素的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示； 所述用于检测志贺毒素的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示； 所述用于检测志贺毒素的探针如序列表中SEQ ID NO. 3所示； 所述探针的5'端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5,所述探针 的3'端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
2. -种用于检测志贺毒素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述 的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反 应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为 0. 03-0. 3%聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0.04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH值 为8. 3的终浓度为0? 01-0. 1M的三（羟甲基）氨基甲烷。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应 体系中包括：终浓度为0. 01U/ y L?0. 05U/ y L的Taq酶、终浓度为0. 2?0. 6mM的dNTPs、 10 XPCR缓冲液和终浓度为1. 5?5. OmM的含Mg离子的溶液。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述临界阳性质控品包括含浓度为 1. OX 104拷贝/mL的志贺毒素基因片段的溶液。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述正向引物和所述反向引物的终浓 度均为0. 05-0. 9 y M，所述探针的终浓度为0. 05-0. 9 y M。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：工作标准品1、工 作标准品2、工作标准品3和工作标准品4,其中， 所述工作标准品1为含有1.〇X 107拷贝/mL的志贺毒素基因的非传染性DNA片段； 所述工作标准品2为含有1. OX 106拷贝/mL的志贺毒素基因的非传染性DNA片段； 所述工作标准品3为含有1. OX 105拷贝/mL的志贺毒素基因的非传染性DNA片段； 所述工作标准品4为含有1. OX 104拷贝/mL的志贺毒素基因的非传染性DNA片段。
9.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品包括含浓度为 1. OX 106拷贝/mL的志贺毒素基因片段的溶液。
10.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为浓度0. 8%的生理 盐水。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测志贺毒素的引物、探针和试剂盒，属于生物技术领域。所述引物和探针包括：用于检测志贺毒素的正向引物、用于检测志贺毒素的反向引物和用于检测志贺毒素的探针。所述试剂盒包括所述的引物和探针。本发明实施例提供的用于检测志贺毒素的引物和探针，具有灵敏度高的特性，使得本发明实施例提供的用于检测志贺毒素的试剂盒，具有灵敏度高的特性；检测速度快，整个检测过程共仅需2～3小时。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104593484
【申请号】CN201410733899
【发明人】刘茹, 桑筱筱
【申请人】湖北永邦医疗科技有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月4日