一种快速选育土霉素菌种的方法_2

文档序号:8294964阅读:来源:国知局
培养基中,于32.0 ± 0.5°C,湿度为40 %,转速为220rpm条件下震荡培养50h,生长到周期后检测发酵液中土霉素含量,选土霉素的含量高于500U/mL的菌株进行砂土干燥保藏。
[0032]验证试验:
[0033](I)试管斜面培养:将步骤a砂土管保藏的生产株及步骤d选出的一株高产菌株分别转接试管斜面,于温度37.0±0.5°C,湿度40%恒温室培养5天,得到斜面孢子。
[0034](2)种子培养:将上述(I)得到的斜面孢子分别转接至种子培养基中,于30.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养30h,得到成熟种液。
[0035](3)发酵培养:将上述(2)得到的成熟种液分别接种到复试用发酵培养基中,于30.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养5天。
[0036]效价检测:发酵培养到周期后使用比色法对发酵单位进行检测。步骤a出发株复试发酵单位为14890U/mL ;步骤d选出的菌株复试发酵单位为19001U/mL。用本方法筛选出的菌株与出发菌株的效价相比明显提高。由此也证明了采用本发明的快速选育土霉素菌种的方法是可行的,可以选育出高产的土霉素菌种,而且验证时间大大缩短。
[0037]实施例2.
[0038]试管斜面培养基按质量百分比的组成为:6.0% -7.0%麸皮,2.0% -2.5%琼脂。
[0039]分离培养基按质量百分比的组成为:2.0% -3.0%玉米淀粉,0.2% -0.5%玉米浆,0.1% -0.3%硫酸铵,0.1% -0.5%碳酸钙,0.3% -0.5%氯化钠,2.0% -2.5%琼脂。
[0040]发酵培养基按质量百分比的组成为:4% -5%玉米淀粉,0.1% -0.2%玉米浆,0.5% -1.0 % 黄豆粉,0.2% -0.3% 硫酸铵,0.2% -0.3% 碳酸钙,0.1% -0.2% 氯化钠,0.01% -0.02%磷酸二氢钾。
[0041]a.试管斜面培养:将土霉素生产菌株砂土孢子接种于试管斜面培养基中,每支试管斜面的砂土孢子接种量为,在温度37.0±0.5°C,湿度60%的条件下培养3天,得到斜面孢子;
[0042]b.孢子悬液制备:向步骤a试管斜面培养基中加入无菌水,将步骤a得到的斜面孢子刮下,混匀,制成孢子悬液,用血球计数板计数,使孢子浓度为112-1O14个/mL ;
[0043]c.分离培养:将步骤b所得的孢子悬液稀释至11-1O7倍,稀释液涂布在分离培养基上,于温度37.0±0.50C,湿度60%的条件下暗培养3天,培养时第一天正置,第二天起倒置培养;
[0044]d.发酵培养:在分离培养基上挑取直径在5mm以上的单菌落接种到25mL发酵培养基中,于32.0 ± 0.5°C,湿度为60 %,转速为200rpm条件下震荡培养48h,生长到周期后检测发酵液中土霉素含量,选土霉素的含量高于500U/mL的菌株进行砂土干燥保藏。
[0045]验证试验:
[0046](I)试管斜面培养:将步骤a砂土管保藏的生产株及步骤d选出的一株高产菌株分别转接试管斜面,于温度37.0±0.5°C,湿度60%恒温室培养3天,得到斜面孢子。
[0047](2)种子培养:将上述⑴得到的斜面孢子分别转接至种子培养基中,于30.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养24h,得到成熟种液。
[0048](3)发酵培养:将上述(2)得到的成熟种液分别接种到复试用发酵培养基中,于30.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养5天。
[0049]效价检测:发酵培养到周期后使用比色法对发酵单位进行检测。步骤a出发株复试发酵单位为14937U/mL ;步骤d选出的菌株复试发酵单位为18890U/mL。用本方法筛选出的菌株与出发菌株的效价相比明显提高。由此也证明了采用本发明的快速选育土霉素菌种的方法是可行的,可以选育出高产的土霉素菌种,而且验证时间大大缩短。
[0050]实施例3.
[0051]试管斜面培养基按质量百分比的组成为:6.0% -7.0%麸皮,2.0% -2.5%琼脂。
[0052]分离培养基按质量百分比的组成为:2.0% -3.0%玉米淀粉,0.2% -0.5%玉米浆,0.1% -0.3%硫酸铵,0.1% -0.5%碳酸钙,0.3% -0.5%氯化钠,2.0% -2.5%琼脂。
[0053]发酵培养基按质量百分比的组成为:4% -5%玉米淀粉,0.1% -0.2%玉米浆,0.5% -1.0 % 黄豆粉,0.2% -0.3% 硫酸铵,0.2% -0.3% 碳酸钙,0.1% -0.2% 氯化钠,0.01% -0.02%磷酸二氢钾。
[0054]a.试管斜面培养:将土霉素生产菌株砂土孢子接种于试管斜面培养基中,每支试管斜面的砂土孢子接种量为,在温度37.0±0.5°C,湿度45%的条件下培养4.5天,得到斜面孢子;
[0055]b.孢子悬液制备:向步骤a试管斜面培养基中加入无菌水,将步骤a得到的斜面孢子刮下,混匀,制成孢子悬液,用血球计数板计数,使孢子浓度为112-1O14个/mL ;
[0056]c.分离培养:将步骤b所得的孢子悬液稀释至11-1O7倍,稀释液涂布在分离培养基上,于温度37.0 ±0.5°C,湿度45 %的条件下暗培养4.5天,培养时第一天正置,第二天起倒置培养;
[0057]d.发酵培养:在分离培养基上挑取直径在5mm以上的单菌落接种到25mL发酵培养基中,于32.0 ± 0.5°C,湿度为45 %,转速为21rpm条件下震荡培养49.5h,生长到周期后检测发酵液中土霉素含量,选土霉素的含量高于500U/mL的菌株进行砂土干燥保藏。
[0058]验证试验:
[0059](I)试管斜面培养:将步骤a砂土管保藏的生产株及步骤d选出的一株高产菌株分别转接试管斜面,于温度37.0±0.5°C,湿度45%恒温室培养4.5天,得到斜面孢子。
[0060](2)种子培养:将上述(I)得到的斜面孢子分别转接至种子培养基中,于30.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养28h,得到成熟种液。
[0061](3)发酵培养:将上述(2)得到的成熟种液分别接种到复试用发酵培养基中,于30.0±0.5°C,220rpm条件下震荡培养5天。
[0062]效价检测:发酵培养到周期后使用比色法对发酵单位进行检测。步骤a出发株复试发酵单位为14873U/mL ;步骤d选出的菌株复试发酵单位为19013U/mL。用本方法筛选出的菌株与出发菌株的效价相比明显提高。由此也证明了采用本发明的快速选育土霉素菌种的方法是可行的,可以选育出高产的土霉素菌种,而且验证时间大大缩短。
[0063]实施例4.
[0064]试管斜面培养基按质量百分比的组成为:6.0% -7.0%麸皮,2.0% -2.5%琼脂。
[0065]分离培养基按质量百分比的组成为:2.0% -3.0%玉米淀粉,0.2% -0.5%玉米浆,0.1% -0.3%硫酸铵,0.1% -0.5%碳酸钙,0.3% -0.5%氯化钠,2.0% -2.5%琼脂。
[0066]发酵培养基按质量百分比的组成为:4% -5%玉米淀粉,0.1% -0.2%玉米浆,0.5% -1.0 % 黄豆粉,0.2% -0.3% 硫酸铵,0.2% -0.3% 碳酸钙,0.1% -0.2% 氯化钠,0.01% -0.02%磷酸二氢钾。
[0067]a.试管斜面培养:将土霉素生产菌株砂土孢子接种于试管斜面培养基中,每支试管斜面的砂土孢子接种量为,在温度37.0±0.5°C,湿度50%的条件下培养4天,得到斜面孢子;
[0068]b.孢子悬液制备:向步骤a试管斜面培养基中加入无菌水,将步骤a得到的斜面孢子刮下,混匀,制成孢子悬液,用血球计数板计数,使孢子浓度为112-1O14个/mL ;
[0069]c.分离培养:将步骤b所得的孢子悬液稀释至11-1O7倍,稀释液涂布在分离培养基上,于温度37.0±0.50C,湿度50%的条件下暗培养4天,培养时第一天正置,第二天起倒置培养;
[0070]d.发酵培养:在分离培养基上挑取直径在5mm以上的单菌落接种到25mL发酵培养基中,于32.0 ± 0.5°C,湿度为50 %,转速为2
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