桑尺蠖微孢子虫 DNA，M 为 DLlOOO Maker。
[0029]图10为引物MC-F/MC-R对柞蚕微孢子虫的灵敏性检测结果，I?8分别为 2.87X 10\2.87X 10。、2.87X 10'2.87X 10'2.87 X 10'2.87 X 10'2.87 X 10'2.87X 1(Γ6 μ g/mL 的柞蚕微孢子虫 DNA，M 为 DLlOOO Maker。
[0030]图11为引物MC-F/MC-R对菜粉蝶微孢子虫的灵敏性检测结果，I?8分别为 1.21 X 11U.21Χ100、1.21 X 10'1.21 X 10'1.21 X 10'1.21 X 10'1.21X10'L 21 X I(Γ6 μ g/mL 的菜粉蝶微孢子虫 DNA, M 为 DL1000 Maker。
[0031]图12为引物MC-F/MC-R对小菜蛾微孢子虫的灵敏性检测结果，I?8分别为 1.21 X 11U.21Χ100、1.21 X 10'1.21 X 10'1.21 X 10'1.21 X 10'1.21X10'1.21 X I(Γ6 μ g/mL 的小菜蛾微孢子虫 DNA, M 为 DL1000 Maker。
[0032]图13为引物MC-F/MC-R对桑螟微孢子虫的灵敏性检测结果，I?8分别为1.8 X 11U.8 X 100、1.8 X 10'1.8 X 10'1.8 X 10'1.8 X 10'1.8 X 10'1.8 X 1(Γ6 μ g/mL的桑螟微孢子虫DNA，M为DL1000 Maker。
[0033]图14为引物2047-F/2047-R对家蚕微孢子虫的灵敏性检测结果，I?8分别为 1.85 X 11U.85 X 10。、1.85 X 10'1.85 X 10'1.85 X 10'1.85 X 10'1.85 X 10'1.85X 1(Γ6 μ g/mL 的家蚕微孢子虫 DNA, M 为 DL1000 Maker。
[0034]图15为引物2047-F/2047-R对菜粉蝶微孢子虫的灵敏性检测结果，I?8分别为1.8 X 11U.8 X 100、1.8 X 10'1.8 X 10'1.8 X 10'1.8 X 10'1.8 X 10'1.8 X 1(Γ6 μ g/mL的菜粉蝶微孢子虫DNA，M为DL1000 Maker。
[0035]图16为引物2047-F/2047-R对小菜蛾微孢子虫的灵敏性检测结果，I?8分别为 1.21 X 101、1.21 X I O0、1.21 X 10' 1.21 X 10' 1.21 X 10' 1.21 X 10' 1.21 X 10'1.21 X KT1 μ g/mL 的小菜蛾微孢子虫 DNA, M 为 DL1000 Maker。
[0036]图17为引物2047-F/2047-R对桑尺蠖微孢子虫和斜纹夜蛾微孢子虫的灵敏性检测结果；I ?8 分别为 1.64X10\l.64X10。、1.64X10'1.64X10'1.64X10'1.64X 10'L 64X 10'L 64Χ 1(Γ6 μ g/mL的桑尺蠖微孢子虫DNA，9?16分别为1.21 X 11U.21X 100、1.21 X 10'1.21 X 10'1.21 X 10'1.21 X 10'1.21Χ 1(Γ5、L 21 X 1(Γ6 μ g/mL的斜纹夜蛾微孢子虫DNA, M为DL1000 Maker。
[0037]图18为引物2047-F/2047-R对桑螟微孢子虫的灵敏性检测结果，I?8分别为1.8 X 11U.8 X 100、1.8 X 10'1.8 X 10'1.8 X 10'1.8 X 10'1.8 X 10'1.8 X 1(Γ6 μ g/mL的桑螟微孢子虫DNA，M为DL1000 Maker。
【具体实施方式】
[0038]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试齐U、方法和设备。
[0039]除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0040]实施例1家蚕微孢子虫Met_AP2基因的克隆 1、引物设计
基于基因组分析数据，对其他物种的Met-AP2基因进行分析，并结合各类微孢子虫基因组进行同源性分析，通过引物设计软件Primer5.0设计了一对引物MC-F/MC-R，引物序列如下所示:
上游引物 MC-F (SEQ ID N0.4):ATGAGGCCTATTGTTTTATCAGAAG ； 下游引物 MC-R (SEQ ID N0.5):TTAAAAATCATCTCCTTTTGTAAGA。
[0041]2、PCR 扩增
分别以家蚕微孢子虫的DNA和cDNA为模板，以引物MC-F/MC-R进行PCR扩增，反应体系和反应程序如下:
所述PCR反应体系(总体积20 μ L):
2 X Taq Master Mix (反应缓冲液)1yL
10 μ M上游引物0.5 yL
10 μ M下游引物0.5 yL
模板 DNAI μ L ；
ddH20补至 20 μ L0
[0042]其中，2XTaq Master Mix (反应缓冲液)的组分为Taq DNA聚合酶，160 mMTris-HCl, 40 mM(NH4)2SO4, 3.0 mM MgCl2,400 μ M dNTP。
[0043]PCR 反应程序为:94°C 5 min ；94°C 30 s，53°C 45 s，72°C 90 s，32 个循环；72°C10 min。
[0044]3、基因克隆
将PCR克隆的片段连接到PMD18-T载体上，然后送去公司(上海生工)进行测序，获得家蚕微孢子虫Met-AP2基因的DNA和cDNA全长序列。Met_AP2基因DNA序列如SEQ ID N0.1所示，Met-AP2基因cDNA序列如SEQ ID N0.2所示。
[0045]另外，应用MEGA5软件通过与其他种微孢子虫基因组基因进行同源性分析，得到了家蚕微孢子虫Met-AP2基因序列编码区，与SEQ ID N0.2所示序列一致。
[0046]4、蛋白分析
Met-AP2基因编码的蛋白序列如SEQ ID N0.3所示。将其在微孢子虫数据库进行同源性比对，比对结果如图2所示。BLAST分析结果表明，家蚕微孢子虫Met-AP2基因与库中蛋白的同源性并不高，而其对于微孢子虫又极为重要，因此该蛋白是一个新发现的基因蛋白。
[0047]实施例2检测引物设计及PCR扩增方法的建立 1、引物设计
(I)在获得家蚕微孢子虫Met-AP2基因的基础上，应用Primer premier 5.0软件设计，设计了 14对引物，各组引物序列如下:
上游引物 MC-F (SEQ ID N0.4):ATGAGGCCTATTGTTTTATCAGAAG ；
下游引物 MC-R (SEQ ID N0.5):TTAAAAATCATCTCCTTTTGTAAGA。
[0048]上游引物2047-F (SEQ ID N0.6):GGAGAAGGGTGATGGAATAG ；
下游引物 2047-R (SEQ ID N0.7):CGACGGTAGATAACCACATA。
[0049]上游引物M6-F (SEQ ID N0.8):CCCCTAAATGAGGCC ；
下游引物 M6-R (SEQ ID N0.9):CCTATTCCATCACCCT。
[0050]上游引物M7-F (SEQ ID N0.10):CCCCTAAATGAGGCC ；
下游引物 M7-R (SEQ ID N0.11):TGGAAGCACGGTAAA。
[0051]上游引物M8-F (SEQ ID N0.12):TTTCTGCTCCCCTAAA ；
下游引物 M8-R (SEQ ID N0.13):TTCCATCACCCTTCTC。
[0052]上游引物M9-F (SEQ ID N0.14):TTTCTGCTCCCCTAAA ；下游引物 M9-R (SEQ ID N0.15):CCTATTCCATCACCCT。
[0053]上游引物MlO-F (SEQ ID N0.16):TTTCTGCTCCCCTAAA ；
下游引物 MlO-R (SEQ ID N0.17):TCCATGATTCTCCCAT。
[0054]上游引物Mll-F (SEQ ID N0.18):AAACTTCCCTCTTACAC ；
下游引物 Mll-R (SEQ ID N0.19):TCGACGGTAGATAACC。
[0055]上游引物M12-F (SEQ ID N0.20):GCTTACTATGATGGGTCT ；
下游引物 M12-R (SEQ ID N0.21):TGAACACGGATACTTTA。
[0056]上游引物M13-F (SEQ ID N0.22):ATCGCCTTGTACTCAT ；
下游引物 M13-R (SEQ ID N0.23):TCGACGGTAGATAACC。
[0057]上游引物M14-F (SEQ ID N0.24):AAATCGCCTTGTACTCA ；
下游引物 M14-R (SEQ ID N0.25):CGACGGTAGATAACCACAT。
[0058]上游引物M15-F (SEQ ID N0.26):AGGAACTCTACCCTTTA ；
下游引物 M15-R (SEQ ID N0.27):TGAACACGGATACTTTA。
[0059]上游引物M16-F (SEQ ID N0.28):AAATCGCCT