青蒿AaGTD1基因及其编码的蛋白与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种青蒿中控制青蒿素合成和腺毛发育的AaGTDI基因及其编码的蛋白与在制备青蒿素中的应用。
【背景技术】
[0002] 疟疾是一种全球性疾病，它威胁着全世界约一半人口的健康。2010年约有2. 19亿 疟疾病例，有66万人死亡。据WHO2013年报道，99个国家和地区有持续性的疟疾传播。来 自无疟疾地区的无免疫力旅客在感染后病情会特别严重。对于疟疾特别是恶性疟现有的最 佳治疗方法，是以青蒿素为基础的联合疗法。青蒿素是一种合成于我国药用植物青蒿腺毛 的倍半萜内酯过氧化物，而且青蒿是青蒿素的唯一天然来源。对于这种每年销售额超过亿 次治疗的药物，青蒿素联合疗法的供应仍然依赖于农业生产的青蒿素。因此，如何最大限度 的提高青蒿素产量，越来越成为人们研宄的重中之重。优良青蒿品种的培育，不仅能降低青 蒿素的成本、稳定供应，而且能提高农民农作物的种植信心。
[0003] 青蒿是主产于我国的一种常见的菊科蒿属的一年生草本植物，20世纪70年代其 提取物青蒿素被发现在抗疟方面与传统的奎宁类抗疟药物具有不同的作用机理且疗效显 著。目前以青蒿素为基础的药剂已成为全球治疗疱疾的首选药物。青蒿素及其衍生物不仅 对疟疾等寄生虫疾病有着重要的作用，同时还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的 功能，对乳腺癌、红斑狼疮、风湿等有显著疗效。开发青蒿素及其衍生物的其它用途将进一 步增大青高素的需求。
[0004] 腺毛是青蒿素体内合成、分泌、积累及储存的场所。青蒿的叶和茎上面布满了这种 腺毛，目前所知道的参与青蒿素合成代谢途径的基因都在腺毛中表达。青蒿素和一些其他 生物活性物质对植物本身有很高的毒性，所以将其扣押在或者分泌出合成部位就显得非常 重要，腺毛的表皮下空间很可能就是青蒿扣押青蒿素和其它植物毒性物质的场所。
[0005] 腺毛是毛状体的一种，毛状体是许多植物叶片和其它器官表面的小突起结构，它 们可以分为两大类：有腺体的和无腺体的。青蒿的腺毛由10个细胞组成，包括两个基底细 胞，两个茎细胞，6个分泌细胞，还有顶部的表皮下空间。其中青蒿素主要在位于外侧的两个 分泌细胞合成，然后分泌到并储存于腺毛最外面的表皮下空间，而内侧的两对分泌细胞含 有叶绿素，具有其它功能。毛状体的最大特征就是他们能够合成，储存，有时候还能分泌大 量特定的代谢产物，包含多种类型的萜烯，苯丙烷衍生物，酰基糖，甲基酮和类黄酮。许多毛 状体产生的化合物具有重要的医药，香料，食品添加剂，天然杀虫剂等商业价值。近年来将 腺毛开发成"化学工厂"来生产高价值的植物产物引起了植物生物技术专家的关注。
[0006] 同时，由于植物表达体系的方便、廉价等有点，利用转基因植物生产药用蛋白越来 越受重视，并迅猛发展，已有100余种蛋白得到表达，有些已进入商业化生产。因此，从青蒿 中分离出参与青蒿腺毛发育和青蒿素合成的基因有重大意义，在药物研发及农业生产上有 重要作用。
[0007] 中国专利申请CN201410374611. 2,发明名称为"青蒿AaMYBLl蛋白编码序列及 其应用"，申请公布号为CN104152463A，公开了一种青蒿MYB-like类转录因子编码序列AaMYBLl，利用转基因技术将青蒿AaMYBLl转录因子干扰载体转化青蒿可以有效调控青蒿 表皮的腺毛密度，从而提高青蒿素的含量。
[0008] 中国专利申请CN201410278312. 9,发明名称为"一种转iaaM基因提高黄花蒿中青 蒿素含量的方法"，申请公布号为CN104059940A，公开了一种构建iaaM基因在黄花蒿腺毛 细胞特异表达的载体，利用根癌农杆菌介导法转化黄花蒿，以提高黄花蒿中青蒿素含量的 方法。
[0009] 中国专利CN201110344258.X，发明名称为"青蒿bHLH转录因子及其编码基因与应 用"，申请公布号为CN102372769A，公开了一种青蒿bHLH转录因子，将bHLH转录因子瞬时转 化到青蒿植株内过表达，其所调控的青蒿素生物合成代谢中的关键酶表达量大幅度提高， 可以用来生产青蒿素。
[0010] 经对现有技术的文献检索发现，尚未有关青蒿AaGTDl基因及其编码的蛋白的报 道。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种青蒿中控制青蒿素合成和腺 毛发育的AaGTDl基因及其编码的蛋白，本发明的另一目的在于提供AaGTDl基因及其编码 的蛋白在制备青蒿素中的应用。
[0012] 本发明是通过以下的技术方案实现的，
[0013] 本发明的第一方面，提供了一种青蒿AaGTDl基因，其核苷酸序列如SEQIDNO: 1 所示。
[0014] 所述的青蒿AaGTDl基因，其核苷酸序列为543bp。
[0015] 本发明的第二方面，提供了一种青蒿AaGTDl基因编码的蛋白，其氨基酸序列如 SEQIDN0:2 所示。
[0016] 所述的青蒿AaGTDl基因编码的蛋白，其氨基酸序列为180aa。
[0017] 本发明的第三方面，提供了一种青蒿AaGTDl基因的表达盒、重组表达载体、重组 菌或转基因植物。
[0018] 所述的青蒿AaGTDl基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因植物中，用于 扩增青蒿AaGTDl基因全长的引物对，所述的引物对中，一条引物序列如SEQIDN0:3所示， 另一条引物序列如SEQIDN0:4所示。
[0019] 所述的青蒿AaGTDl基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因植物中，所述 的重组表达载体为质粒PHB_35SX2-AaGTDl。
[0020] 所述的青蒿AaGTDl基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因植物中，所述 的重组菌，即宿主细胞，为大肠杆菌、农杆菌等。
[0021] 所述的青蒿AaGTDl基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因植物中，所述 的转基因植物为转基因黄花蒿。
[0022] 本发明的第四方面，提供了青蒿AaGTDl基因、青蒿AaGTD1基因编码的蛋白，以及 青蒿AaGTDl基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或转基因植物，在制备青蒿素中的应用。
[0023] 进一步地，本发明提供了青蒿AaGTDl基因编码的蛋白在作为转录因子的应用。
[0024] 本发明的AaGTDl基因编码的蛋白是一个AP2/ERF类的转录因子，AaGTDl基因表 达在青蒿幼嫩叶片和花苞中，参与了青蒿腺毛的发育和青蒿素的合成，因此可以用来生产 新的高青蒿素含量的青蒿品系，在农业生产上具有十分重要的应用。
[0025] 所述的应用，具体是：通过转基因方法提高植物组织中青蒿AaGTDl基因的表达 量；
[0026] 所述的应用，具体是：青蒿AaGTDl基因在提高植物组织中与促进青蒿素合成相关 的酶的编码基因的表达量中的应用，所述的促进青蒿素合成相关的酶的编码基因是ADS、 CYP71AV1，或DBR2
[0027] 所述的植物为黄花蒿。
[0028] 本发明的第五方面，提供了一种提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，包含以下步 骤：
[0029]A、构建青蒿AaGTDl基因的重组表达载体；优选的，是将如SEQIDNO: 1所示的 AaGTDl基因连于植物表达调控序列上，构建含重组的植物表达载体；
[0030] B、将步骤A的重组表达载体转入宿主细胞农杆菌，优选的宿主细胞为农杆菌 H1105;并将其转化青蒿的愈伤组织；
[0031] C、通过抗生素筛选得到转化成功的青蒿细胞，并培育使之长成完整植株；所得的 转基因植株中青蒿素含量得到提高。
[0032] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明的AaGTDl基因编码的蛋白 可以用来生产新的高青蒿素含量的青蒿品系，在青蒿素的获得和农业生产上具有十分重要 的应用；此外，该基因编码一个AP2/ERF类的转录因子，能够与青蒿素合成路径中的关键酶 基因ADS，CYP71AV1的启动子相结合，并调控ADS，CYP71AV1基因的表达，从而调控青蒿素的 合成。细胞生物学分析表明抑制AaGTDl基因的表达可以使青蒿的分泌型和非分泌型腺毛 都发育异常，因此AaGTDl基因也参与了青蒿腺毛的发育，并起到了非常重要的作用。
【附图说明】
[0033] 图lAaGTDl基因的结构域示意图。
[0034] 图2RT-PCR显示AaGTDl基因的时空表达模式，其中A为AaGTDl基因在根、茎、老 叶、嫩叶、幼嫩花苞、成熟花苞及花中的表达情况。B为AaGTDl基因在