基因敲除的方法，包括：
[0008] (1)将pIRES-ne〇2载体经XhoI酶切后，将扩增得到的3'同源臂，通过同源重组 的方法将3'同源臂插入到pIRES-ne〇2载体的XhoI位点；然后载体经NruI酶切后，将扩 增得到的5'同源臂，通过同源重组的方法将5'同源臂插入到neo-XhoI载体的NruI位 点，得到neo-XhoI-NruI载体；
[0009] (2)将pIRES-ne〇2载体在克隆位点双酶切后，将从pEGFP-Cl载体上切割下来的 EGFP基因插入载体中，得到neo-EGFP载体；载体经XhoI酶切后，将扩增得到的3'同源臂， 通过同源重组的方法将3'同源臂插入到neo-EGFP载体的XhoI位点；然后载体经NruI酶切后，将扩增得到的5'同源臂，通过同源重组的方法将5'同源臂插入到neo-EGFP-XhoI 载体的NruI位点，得到neo-EGFP-XhoI_NruI载体；
[0010] (3)将CRISPR/Cas系统载体和neo-XhoI-NruI载体共同转染哺乳动物细胞，将 mir-505基因被外源neo基因替换，通过G418抗性筛选得到mir-505单等位基因敲除细胞； 再一次将CRISPR/Cas系统载体和neo-EGFP-XhoI-NruI载体共同转染mir-505单等位基 因敲除细胞，将另一条mir-505基因被外源EGFP和neo基因替换，挑选得到表达绿色荧光 蛋白的细胞即mir-505双等位基因敲除细胞。
[0011] 所述步骤⑴和⑵中的3'同源臂具体为：以HEK293A细胞基因组DNA为模板， 利用HotstartTaq酶特异性扩增得到的858bpmir-505基因的3'同源臂。
[0012] 所述步骤（1)中的5'同源臂具体为：以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用 HotstartTaq酶特异性扩增得到的1559bpmir-505基因的5'同源臂。
[0013] 所述步骤（2)中的5'同源臂具体为：以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用 HotstartTaq酶特异性扩增得到的444bpmir-505基因的5'同源臂。
[0014] 所述步骤（2)中的双酶切为EcoRV和BamHI双酶切。
[0015] 所述步骤（2)中的EGFP基因插入载体采用T4连接酶酶连的方法插入。
[0016] 所述步骤（3)中的哺乳动物细胞为HEK293A细胞。
[0017] 本发明旨在建立一种在哺乳动物细胞中将mir-505基因进行双等位基因敲除的 方法。首先针对mir-505基因位点设计sgRNA，并将其插入到sgRNA表达载体（42230载体） 中。随后根据mir-505基因，分别设计两种打靶载体--neo-EGFP-XhoI-NruI载体（携 带绿色荧光蛋白基因和新霉素基因的打靶载体）和neo-XhoI-NruI载体（只携带新霉素 基因的打靶载体）。由于通过CRISPR/Cas系统能够在mir-505靶点发生双链断裂，从而大 大增加打靶载体发生同源重组的效率，因此在CRISPR/Cas系统介导下通过打靶载体发生 同源重组将整个mir-505基因替换敲除，从而在哺乳动物细胞中将mir-505基因进行双等 位基因敲除。
[0018] 本发明技术方案包括分别构建两种针对mir-505基因的打靶载体，即在 pIRES-neo2载体的XhoI位点和NruI位点插入mir-505基因3'和5'同源臂，其中一个 打靶载体还会在多克隆位点插入EGFP基因。构建好载体后对载体进行菌落PCR检测和测序 确认，从而得到mir-505基因的打祀载体-neo-EGFP-XhoI_NruI载体和neo-XhoI_Nru I载体。
[0019] 先将构建好的neo-XhoI-NruI载体和针对mir-505基因的CRISPR系统质粒共 同转染哺乳动物细胞。转染24小时后，加入700ug/ml的G418进行抗性筛选，筛选4周 后得到mir-505单等位基因敲除细胞。提取细胞基因组DNA，通过real-timePCR方法对 mir-505基因拷贝数进行检测，检测基因敲除情况。在此基础上，再一次利用CRISPR系统和 neo-EGFP-XhoI-NruI载体对单等位基因敲除细胞进行基因敲除，得到能表达绿色荧光蛋 白的细胞就是mir-505双等位基因敲除细胞。
[0020] 本发明构建了能够在哺乳动物细胞中能够将mir-505整体敲除的两种打靶载 体--带EGFP打靶载体和不带EGFP打靶载体。通过两次CRISPR系统介导下结合打靶载体， 分别两次对mir-505基因进行敲除，从而构建mir-505双等位基因敲除细胞。本发明在构建 neo-EGFP-XhoI-NruI载体是在pIRES-neo2载体的多克隆位点插入EGFP片段，在正确插 入的载体上，再在XhoI位点和NruI位点插入mir-505基因两条同源臂。在构建neo-Xho I-NruI载体是在pIRES-neo2载体在XhoI位点和NruI位点插入mir-505基因两条同源 臂。最后都通过菌落PCR和测序得到正确构建的打靶载体。先将构建好的neo-XhoI-Nru I载体和针对mir-505基因的CRISPR系统质粒共同转染哺乳动物细胞。转染一段时间后， 加入700ug/ml的G418进行抗性筛选，筛选4周后得到mir-505单等位基因敲除细胞。提 取细胞基因组DNA，通过real-timePCR方法对mir-505基因拷贝数进行检测，检测基因敲 除情况。在此基础上，再一次利用CRISPR系统和neo-EGFP-XhoI-NruI载体对单等位基 因敲除细胞进行基因敲除，得到能表达绿色荧光蛋白的细胞就是mir-505双等位基因敲除 细胞。由于一次敲除，通过同源重组一般只能敲除其中一条等位基因，通过两种打靶载体， 两次敲除能够筛选得到双等位基因敲除细胞，为构建基因彻底敲除细胞模型提供帮助。
[0021] 有益效果
[0022] 本发明构建了能够在哺乳动物细胞中能够将mir-505整体敲除的两种打靶载 体--带EGFP打靶载体和不带EGFP打靶载体。通过两次CRISPR系统介导下结合不同的 打靶载体，分别两次对mir-505基因进行敲除，两次可以分别用不同的筛选方式进行筛选， 以区分单敲除和双敲除细胞，从而构建mir-505双等位基因敲除细胞。
[0023] 本发明在构建neo-EGFP-XhoI-NruI载体是在pIRES-neo2载体的多克隆位点插 入EGFP片段，在正确插入的载体上，再在XhoI位点和NruI位点插入mir-505基因两条同 源臂。在构建neo-XhoI-NruI载体是在pIRES_neo2载体在XhoI位点和NruI位点插 入mir-505基因两条同源臂。最后都通过菌落PCR和测序得到正确构建的打靶载体。先将 构建好的neo-XhoI-NruI载体和针对mir-505基因的CRISPR系统质粒共同转染哺乳动 物细胞。转染一段时间后，加入700ug/ml的G418进行抗性筛选，筛选4周后得到mir-505 单等位基因敲除细胞。提取细胞基因组DNA，通过real-timePCR方法对mir-505基因拷 贝数进行检测，从结果发现通过一次CRISPR系统介导的mir-505基因敲除结果普遍发生单 等位基因敲除。为了能够将mir-505进行彻底敲除即双等位基因敲除，因此在此基础上， 再一次利用CRISPR系统和neo-EGFP-XhoI-NruI载体对单等位基因敲除细胞进行基因敲 除，得到能表达绿色荧光蛋白的细胞就是mir-505双等位基因敲除细胞。由于一次敲除，通 过同源重组一般只能敲除其中一条等位基因，通过两种打靶载体的结合使用，通过两次敲 除能够筛选得到双等位基因敲除细胞，为构建基因彻底敲除细胞模型提供方法学帮助。
【附图说明】
[0024] 图1为EGFP酶切片段及pIRES-neo2载体双酶切电泳图；其中，1为pEGFP-Cl经 NheI和BglII双酶切，2 为pIRES-neo2 载体经EcoRV和BamHI双酶切，M为DNAmarker;
[0025] 图2为候选neo-EGFP载体酶切鉴定电泳图；其中，1为neo-EGFP-1#酶切，2为 neo-EGFP-1# 未酶切，3 为neo-EGFP-5# 酶切，4 为neo-EGFP-5# 未酶切，5 为neo-EGFP-6# 酶切，6为neo-EGFP-6#未酶切，7为pIRES-neo2酶切，8为pIRES-neo2未酶切，M为DNA marker；
[0026] 图3为mir-505基因3'同源臂扩增电泳图；其中，1-4为3'同源臂，M为DNA ma