rker；
[0027] 图4为neo-EGFP-Xho I载体菌落PCR鉴定结果；其中，1-16为单菌落，M为DNA marker；
[0028] 图5为mir-505基因3'同源臂扩增电泳图；其中，1为5'同源臂，M为DNAmarker;
[0029] 图6为neo-EGFP-XhoI-NruI载体菌落PCR鉴定结果；其中，1-16为单菌落，M为 DNAmarker；
[0030] 图7为neo-Xho I载体菌落PCR鉴定结果；其中，1-16为单菌落，M为DNA marker ;
[0031] 图8为mir-505基因3'同源臂扩增电泳图；其中，1为5'同源臂，M为DNAmarker;
[0032] 图9为neo-XhoI-NruI载体菌落PCR鉴定结果；其中，1-16为单菌落，M为DNA marker；
[0033] 图10为经G418筛选后的mir-505单等位基因敲除细胞；
[0034] 图11为mir-505基因拷贝数检测结果；其中，9-13#为筛选得到的 mir-505knockout细胞，WT为HEK293A细胞；
[0035] 图12为mir-505双等位基因敲除细胞；
[0036] 图13为本发明打靶载体构建图及敲除原理。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0038] 实施例1
[0039] (1)构建neo-EGFP-Xho I-NruI载体（带EGFP打靶载体）
[0040]A.EGFP片段的获得
[0041] 以pEGFP-Cl载体为供体，通过酶切的方式得到EGFP片段。先用NheI单酶切 pEGFP-Cl载体，并用Klenow酶将粘性末端补平，从而变成平末端，在此基础上再用BglII 进行单酶切，从而获得一端是平末端而另一端是粘性末端的EGFP片段。酶切产物经过1 % 琼脂糖凝胶电泳后，如图1所示，pEGFP-Cl载体的确被切出了一条750bp的小片段，这个小 片段就是实验所需的EGFP片段，随后利用割胶回收的方法获得EGFP片段。
[0042]B?构建neo-EGFP载体
[0043]pIRES_neo2载体经EcoRV和BamHI双酶切线性化处理后，形成一段是平末端 而另一端是粘性末端的线性化载体。而所得到的EGFP片段同样具有一端是平末端而另一 端是粘性末端的特性。利用T4连接酶酶连的方法将EGFP片段插入到pIRES-ne〇2载体 中，从而构建重组质粒neo-EGFP，随后将重组质粒进行转化。随机挑选3个单菌落（1#， 5#，6#)提取质粒，并进行单酶切鉴定，结果如图2所示。经单酶切鉴定后发现，质粒大小为 ne〇-EGFP-l#>ne〇-EGFP-5# =pIRES-neo2>neo_EGFP-6#。据此判断，neo-EGFP-1# 中插入 了EGFP片段，而其余两个候选质粒没有插入目的片段。
[0044]C.PCR扩增mir-505基因3'同源臂
[0045] 以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用Hotstart Taq酶特异性扩增mir-505基 因的3'同源臂。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，能够在858bp处出现单一条带，证明扩增 特异性良好，结果如图3所示。用下列一对引物进行PCR扩增：EGFP-505-R-F:CCAGCTGGGG CTCGAGGGAGCATCGCCAAGTTCG;EGFP-505-R-R:CTAGAATGCACTCGAGGCCAGTGCCTCCTTCTGA。
[0046] D?构建neo-EGFP-Xho I载体
[0047] 将载体neo-EGFP经Xho I单酶切线性化处理后，3'同源臂的两端与线性化载 体两端具有碱基同源性，利用同源重组的方法将插入片段整合插入neo-EGFP载体中，从 而构建重组质粒neo-EGFP-Xho I。随后将重组质粒进行转化，随后挑选单菌落进行菌落 PCR鉴定，鉴定结果如图4所示。用下列一对引物对单菌落进行PCR鉴定：neo2-Xho I-L: ITGGGAAGACAATAGCAGGC ;neo2-Xho I - R :CCATGATTACGCCAAGCTCT。经菌落PCR反应后跑琼 脂糖凝胶电泳，结果会出现两种情况：一种是在173bp处出现条带，这表示目的片段并没有 插入到载体中，因此扩增出短片段；另一种是在l〇〇4bp处出现条带，这表示目的片段成功 插入到载体中，因此能够扩增出长片段。
[0048] 为了确保插入片段的碱基是完全正确的，随后将菌落PCR筛选出的阳性克隆 进行测序鉴定。测序引物：neo2-Xho I-L:ITGGGAAGACAATAGCAGGC ;neo2-Xho I- R : CCATGATTACGCCAAGCTCT。
[0049]E.PCR扩增mir-505基因5'同源臂
[0050] 以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用HotstartTaq酶特异性扩增mir-505基 因的5'同源臂。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，能够在444bp处出现单一条带，证明扩 增特异性良好，结果如图5所示。用下列一对引物进行PCR扩增：EGFP-505-L-F:TTTTGCGC TGCTTCGCGAACGCTTGCGGATGTGATT;EGFP-505-L-R:CTGGCCCGTACATCGCGATTGGTCCTTGGCTGGT GT〇
[0051] F?构建neo-EGFP-Xho I_NruI载体
[0052] 将载体neo-EGFP-XhoI经NruI单酶切线性化处理后，5'同源臂的两端与线性 化载体两端具有碱基同源性，利用同源重组的方法将插入片段整合插入neo-EGFP-XhoI载 体中，从而构建重组质粒neo-EGFP-XhoI-NruI。随后将重组质粒进行转化，随后挑选单 菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定结果如图6所示。用下列一对引物对单菌落进行PCR鉴定： neo2-NruI-L:GCTACAACAAGGCAAGGCTT;neo2-NruI-R:GTCAACGCGTATATCTGGCC。经菌落 PCR反应后跑琼脂糖凝胶电泳，结果会出现两种情况：一种是在103bp处出现条带，这表示 目的片段并没有插入到载体中，因此扩增出短片段；另一种是在516bp处出现条带，这表示 目的片段成功插入到载体中，因此能够扩增出长片段。
[0053] 为了确保插入片段的碱基是完全正确的，随后将菌落PCR筛选出的阳性克隆 进行测序鉴定。测序引物：neo2-NruI-L:GCTACAACAAGGCAAGGCTT;neo2-NruI-R: GTCAACGCGTATATCTGGCC。
[0054] (2)构建neo-XhoI-NruI载体（不带EGFP打靶载体）
[0055]A.PCR扩增mir-505基因3'同源臂
[0056] 以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用HotstartTaq酶特异性扩增mir-505基 因的3'同源臂。扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，能够在858bp处出现单一条带，证明扩增 特异性良好。用下列一对引物进行PCR扩增：505-R-F:CCAGCTGGGGCTCGAGGGAGCATCGCCAAG TTCG;505-R-R:CTAGAATGCACTCGAGGCCAGTGCCTCCTTCTGA。
[0057] B?构建neo-XhoI载体
[0058] 将载体pIRES-ne〇2经Xho I单酶切线性化处理后，3'同源臂的两端与线性化 载体两端具有碱基同源性，利用同源重组的方法将插入片段整合插入pIRES-ne〇2载体 中，从而构建重组质粒neo-Xho I。随后将重组质粒进行转化，随后挑选单菌落进行菌落 PCR鉴定，鉴定结果如图7所示。用下列一对引物对单菌落进行PCR鉴定：neo2-Xho I-L: ITGGGAAGACAATAGCAGGC ;neo2-Xho I - R :CCATGATTACGCCAAGCTCT。经菌落PCR反应后跑琼 脂糖凝胶电泳，结果会出现两种情况：一种是在173bp处出现条带，这表示目的片段并没有 插入到载体中，因此扩增出短片段；另一种是在l〇〇4bp处出现条带，这表示目的片段成功 插入到载体中，因此能够扩增出长片段。
[0059] 为了确保插入片段的