/RNA提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548)提取 猪圆环病毒2型或疑似猪圆环病毒2型感染的病变组织的DNA/RNA，以及对照病毒的基因组 DNA/RNA〇
[0025] 4、LAMP反应体系建立 按照试剂盒说明书，按25y1体系配置： 2X反应缓冲液 12. 5yL Bst DNA聚合酶 1yL FIP 40 pmol BIP 40 pmol F3 5pmol B3 5pmol 猪圆环病毒DNA 2yL 超纯水 补足25 yL。
[0026]LAMP反应在以实时浊度仪（LA-320C，日本荣研公司）进行密闭全程监控的形式 监测本方法的检出情况，浊度仪实时监控扩增情况，可绘制标准曲线，通过获得未知样品达 到〇. 1浊度值对应的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，反应温度以 63 °C做为反应温度。
[0027] 5、LAMP检测方法 1)特异性检测 使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取猪圆环病毒2型以及对照毒株-猪瘟病毒、 猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻 病毒、细小病毒的基因组DNA/RNA，作为LAMP反应的模板，同时以水作为空白对照，检验 LAMP方法的特异性。
[0028] 2)敏感性检测 提取的猪圆环病毒2型基因组DNA，测定其浓度，用RNA-FreeWater连续10倍倍比稀 释成10个稀释度，以各DNA稀释度作为模板，进行LAMP扩增和PCR扩增，对比本发明的LAMP 方法和普通PCR方法对检测圆环病毒2型的敏感性。
[0029] 3)荧光可视化检测 根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，荧光染料在反应前加入，加入的染料为钙 黄绿素商用染料，63°C下反应30分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线 分析显像，避免开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染实验室。
[0030] 实施例1LAMP检测方法的特异性结果 对1株猪圆环病毒2型、7株对照病毒和水对照进行LAMP扩增，结果如图1所示，猪圆 环病毒2型反应管在20分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，7株对照病毒反应管和 水对照反应管均无扩增情况出现，为阴性结果。
[0031] 实施例2LAMP检测方法的敏感性结果 猪圆环病毒2型基因组DNA的起始浓度为1. 27X102ng/yL，经10倍倍比连续稀释后， 进行LAMP和普通PCR扩增，结果如图2和图3所示，结果显示本发明的LAMP法检测限约为 1. 27X10_3ng/yL，而普通PCR法检测限为 1. 27X10_2ng/yL。
[0032] 实施例3LAMP检测方法的荧光可视化检测结果 根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，63°C反应60分钟后，在紫外灯下观察，图 4为观察结果，左管为以猪圆环病毒2型DNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对 照，为阴性结果。试验结果表明，建立的LAMP方法可以方便基层使用，只需使用试剂盒配合 本方法设计的LAMP引物，加入样品后，用低廉的水浴锅来保持63°C60分钟，即可快速观察 结果，且无需开盖，避免了污染。
[0033] 实施例4猪圆环病毒2型定量标准曲线的绘制 以猪圆环病毒2型DNA为模板，以本LAMP方法设计的外引物F3和B3为PCR扩增引物， 将PCR扩增得到的目的基因片段连接于载体pMD18-T，转化大肠杆菌感受细胞DH5a，氨苄西 林抗性筛选获得单克隆菌，提取重组的质粒DNA，经测序确认后，作为标准样品，测定重组质 粒pMD18-T-/fe/7的起始浓度，用RNA-FreeWater进行连续10倍倍比稀释8个稀释度，取各 稀释度2yL作为模板进行LAMP扩增， 设置对照：浓度为 1. 68X102ng/yL、1. 68X101ng/yL、1. 68X10。ng/yL、1. 68XKT1 ng/yL、l. 68X10 2ng/yL、l. 68X10 3ng/yL、l. 68X10 4ng/yL、l. 68X10 5ng/yL、 1. 68X10_6ng/yL、l. 68X10_7ng/yL的标准重组质粒pMD18-T-/fe/7样品各一个，因为浓 度的负对数值与浊度值为〇. 1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间 (如表1)做成标准曲线，获得标准曲线方程，y=〇. 2615x-8. 2746,如图5所示。从标准曲线 方程来看相关系数R2为〇. 9932,呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的 负次方数，则浓度为l〇-y，再乘以基数1.68,即为1.68xl(Tng/yL。依据拷贝数换算公 式copies/yL= (6.02x1023x(ng/ulx1CT9)) /(DNAlengthx660)，DNAlength为 载体序列大小加上目的基因序列大小，为2693+220=2913bp，将其换算成拷贝数（copies/ yL):6.02x1023x(2.05xl(Tyx1(T9)/ (2913x660)，简化为：5.25x108xl(Ty。如 某试验样品达到浊度值为0. 1的时间为30分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等 于-1. 3296,则浓度为101 3296,再乘以基数1. 68,即为该试验样品的浓度1. 68X101 3296ng/ UL，拷贝数为5.25x108xlO13296,即为5.25xl(f3296copies/yL，从而达到定量的效果。
[0034]表1
【主权项】
1. 一种猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括LAMP引物、2X 反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪圆环病毒DNA模板；所述的 LAMP 引物包括外引物 F3 (SEQ ID N0:1)与 B3 (SEQ ID N0:2)、内引物 FIP (SEQ ID NO: 3)与 BIP (SEQ ID NO :4)和环引物 LF (SEQ ID NO :5)与 LB (SEQ ID NO :6); 其中： F3 GGGAGTCTGGTGACCGTT B3 CCATCCCACCACTTGTTTCT FIP ACGCTTCTGCATTTTCCCGCTCGAGCAGCACCCTGTAACG BIP CACGTCATTGTGGGGCCACCTTCCAGTATGTGGTTTCCGG LF TTCAAAAGTTCAGCCAGCCC LB TGTGGTAAAAGCAAATGGGCT ； 所述的 2X 反应缓冲液是 Tris_HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine 和 dNTPs〇
2. 根据权利要求1所述的猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的猪 圆环病毒DNA模板提取自猪圆环病毒培养物，是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取。
3. 根据权利要求1所述的猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，述的荧光 目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
4. 根据权利要求1所述的猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的 2X 反应缓冲液包括 Tris-HCL 35-55mM、KCL 10-30mM、MgS04 15-28mM、（NH4)2SO4 18-28mM、 Tween20 0· 5_1· 5 %、Betaine I. 3_3· 5M 和 dNTPs 2· 4-4. 8mM〇
5. -种猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，于兽医临床上检测疑 似猪圆环病变组织是否含有猪圆环病毒，具体检测步骤包括： (1) LAMP引物的设计与合成 (2) 检测猪圆环病毒DNA模板的提取 (3) LAMP反应体系建立 (4) LAMP检测方法。
6. 根据权利要求5所述的猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所 述的LAMP反应体系建立以25 μ 1计， 2X反应缓冲液 12. 5 yL Bst DNA聚合酶 IyL FIP 40 pmol BIP 40 pmol F3 5 pmol B3 5 pmol 猪圆环病毒DNA 2 μ L 超纯水 补足25 μ L。
7. 根据权利要求5所述的猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所 述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。
8. 根据权利要求5所述的猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所 述的LAMP检测方法采用实时浊度仪进行密闭全程监控。
【专利摘要】本发明公开了一种猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪圆环病毒DNA模板；所述的LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF与LB。特异性检测和敏感性检测证实，本发明提供的环节导等温扩增试剂盒可实时监测反应并且定量检测出猪圆环病毒的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪圆环病毒带来便利。
【IPC分类】C12R1-93, C12Q1-70, C12Q1-68
【公开号】CN104651534
【申请号】CN201510095320
【发明人】彭昊, 李军, 冯世文, 潘艳, 陈泽祥, 胡帅, 杨威, 钟舒红, 谢宇舟, 禤雄标, 马春霞, 陶立, 柳锋, 谢永平, 许力干, 韦志锋, 秦若甫, 兰美益
【申请人】广西壮族自治区兽医研究所
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月4日