[0039] 在本说明书通篇，除非上下文另有要求，否则词语"包含（comprise) "或其变化形 式（如"包含了（comprises)"或"包含着（comprising)"）将理解为暗示包括一个陈述的 元件或整数或者元件或整数组但不排除任何其他元件或整数或者元件或整数组。
[0040] 一种免疫原性多肽被定义为诱导一种生物样品或当前或先前感染一种毒性分枝 杆菌的一名个体中的一种免疫反应的一种多肽。
[0041] 免疫反应可以通过以下方法之一来监测：
[0042] ?-种体外细胞反应通过由从当前或先前感染毒性分枝杆菌的一种动物或人类抽 取的淋巴细胞释放一种相关细胞因子（如IFN-γ )，或通过检测这些T细胞的增殖来测定。 诱导通过以下方式进行：添加多肽或免疫原性部分到包含从IX IO5个细胞到3X10 5个细 胞/孔的一种悬浮液中。将细胞从血液、脾、肝或者肺中分离，并且添加多肽或免疫原性部 分，产生不超过20 μ g/ml悬浮液的一个浓度，并且进行刺激从两天到五天。为了监测细胞 增殖，将细胞用放射性标记的胸苷脉冲，并且在16-22小时的孵育之后，通过液体闪烁计数 检测增殖。一种阳性反应是大于本底加两个标准差的一种反应。IFN-γ的释放可以通过 ELISA方法测定，该方法为本领域的普通技术人员所熟知。一种阳性反应是大于本底加两 个标准差的一种反应。当监测对多肽的免疫反应时，不同于IFN-γ的细胞因子可以是相 关的，如IL-12、TNF-a、IL-4、IL-5、IL-10、IL-6、TGF-0。用于测定一种细胞因子（例如 IFN-γ )的存在的另一种并且更灵敏的方法是ELISPOT方法，其中将从血液、脾、肝或者肺 中分离的细胞稀释到优选1到4Χ IO6个细胞/毫升的一个浓度，并且在多肽或免疫原性部 分存在下孵育18-22小时，产生不超过20 μ g/ml的一个浓度。此后将细胞悬浮液稀释到1 到2X 106/ml，并且转移到涂布有抗IFN-γ的Maxisorp板，并且孵育优选地4到16小时。 产生IFN-γ的细胞通过使用被标记的二级抗IFN-γ抗体和一种相关底物来测定，产生斑 点，这些斑点可以使用一个解剖显微镜进行计数。还可能的是通过使用PCR技术测定编码 相关细胞因子的mRNA的存在。通常一种或多种细胞因子将利用例如PCR、ELISP0T或ELISA 测量。本领域的普通技术人员应了解，这些细胞因子中的任一者的量由一种特异性多肽诱 导的显著增加或减少可以用于评估多肽的免疫活性。
[0043] ?一种体外细胞反应还可以通过使用来源于一名免疫个体或一个被结核分枝杆菌 感染的人的T细胞系来测定，其中已经在添加 IL-2的情况下用活分枝杆菌、来自细菌细胞 的提取物或者培养滤液驱动T细胞系10天到20天。诱导通过以下方式进行：添加不超过 20 μ g多肽/ml悬浮液到含有从I X IO5个细胞到3 X 10 5细胞个/孔的T细胞系中，并且进 行孵育从两天到六天。IFN-γ的诱导或另一种相关细胞因子的释放通过ELISA来检测。T 细胞的刺激还可以如上文所描述通过使用放射性标记的胸苷检测细胞增殖来监测。对于两 种分析，一种阳性反应都是大于本底加两个标准差的一种反应。
[0044] ?-种体内细胞反应可以按在皮内注射或局部施用贴片至多IOOyg的多肽或免 疫原性部分到临床或亚临床感染一种毒性分枝杆菌的一名个体之后的一种阳性DTH反应 形式测定，一种阳性反应在注射或施用之后具有至少5mm的一个直径72-96小时。
[0045] ?-种体外体液反应通过一名免疫或被感染的个体中的一种特异性抗体反应来测 定。抗体的存在可以通过一种ELISA技术或一种蛋白质印迹法测定，其中多肽或免疫原性 部分被吸收到或者一个硝酸纤维膜或者一个聚苯乙烯表面。将血清优选地在PBS中从1:10 稀释到1:100,并且添加到被吸收的多肽中，并且进行孵育从1到12小时。通过使用被标记 的二级抗体，可以通过例如通过ELISA测量OD来测定特异性抗体的存在，其中一种阳性反 应是大于本底加两个标准差的一种反应或可替代地一种蛋白质印迹法中的一种视觉反应。
[0046] ?另一种相关参数是动物模型中的在用一种佐剂中的多肽接种疫苗之后或在DNA 疫苗接种之后诱导的保护的量度。适合的动物模型包括灵长类动物、天竺鼠或小鼠，用一种 毒性分枝杆菌的感染对其进行攻击。诱导的保护的读出可以是与未被接种疫苗的动物相比 的标靶器官中细菌负荷降低、与未被接种疫苗的动物相比的延长存活时间以及与未被接种 疫苗的动物相比的减小体重减轻。
[0047] 免疫原性部分
[0048] 在本发明的一个优选实施例中，多肽包含多肽的一种免疫原性部分，如一种B细 胞或T细胞的一种表位。一种多肽的免疫原性部分是多肽的通过在此所描述的生物分析 中的任一者所测定引发一种动物或一名人类中和/或一种生物样品中的一种免疫反应的 一个部分。一种多肽的免疫原性部分可以是一种T细胞表位或一种B细胞表位。免疫原性 部分可以与多肽的一个或几个相对小的部分相关，它们可以散开遍及多肽序列或位于多肽 的特定部分中。对于几种多肽，表位甚至已经被展示为散开遍及多肽，涵盖全序列（拉夫恩 (Ravn)等人 1999)。
[0049] 为了鉴别在一种免疫反应期间识别的相关T细胞表位，有可能使用一种"强力"方 法：因为T细胞表位是线性的，所以多肽的缺失突变体在系统地构筑时将显示多肽的什么 区域在免疫识别中是必需的，例如通过使这些缺失突变体经历例如在此所描述的IFN-γ 分析。另一种方法利用重叠寡肽来检测MHC II类表位，优选地合成的，具有例如20个来源 于多肽的氨基酸残基的长度。这些肽可以在生物分析（例如如在此所描述的IFN-γ分析） 中进行测试，并且这些肽中的一些将给出一种阳性反应（并且由此是免疫原性的），是肽中 存在一种T细胞表位的证据。对于MHC I类表位的检测，有可能预测将结合的肽（斯特林 (Stryhn)等人1996)并且此后合成产生这些肽并且在相关生物分析（例如如在此所描述的 IFN-γ分析）中测试其。肽优选地具有例如8到11个来源于多肽的氨基酸残基的长度。 B细胞表位可以通过分析对涵盖所关注的多肽的重叠肽的B细胞识别来测定，如例如哈博 (Harboe)等人1998中所描述。
[0050] 尽管一种T细胞表位的最小长度已经显示是至少6个氨基酸，但通常此类表位由 更长延伸的氨基酸构成。
[0051] 多肽的免疫原性部分可以通过遗传异种人类群体的广泛部分（高频率）或微小 部分（低频率）识别。另外，一些免疫原性部分诱导高免疫反应（显性），而其他诱导更 低但仍显著的反应（亚显性）。高频率〉〈低频率可以与结合到广泛分布的MHC分子（HLA 型）或甚至多重MHC分子的免疫原性部分相关（基尔古斯（Kilgus)等人1991，西尼加利亚 (Sinigaglia)等人 1988)。
[0052] 然而，在提供用于一种针对结核的新疫苗的候选分子的情况下，亚显性表位与显 性表位一般相关，因为已经显示（W02008000261)此类表位可以无关于亚显性而诱导保护。
[0053] 本发明的多肽的一种常见特征是其诱导一种免疫反应的能力，如实例中所示。应 理解，一种本发明的多肽通过取代、插入、添加或缺失而产生的一种变异体通过在此所描述 的分析中的任一者所测定也是免疫原性的。
[0054] 融合蛋白
[0055] 术语"融合蛋白"被理解为来自结核分枝杆菌的两种或更多种免疫原性多肽的一 个随机顺序或其类似物，用或不用一个或多个任意长度和序列的氨基酸连接子/间隔子融 合在一起。为了避免下游产生中的蛋白质聚集，融合蛋白中的所有半胱氨酸都可以被任何 氨基酸置换，但丝氨酸由于其与半胱氨酸的高构造类似性而是优选的取代物。
[0056] 连接子
[0057] 连接子或间隔子是存在于一种融合蛋白中的多肽伴侣之间的短肽序列。连接子通 常由柔性残基（如甘氨酸和丝氨酸）组成，以便相邻蛋白质结构域相对于彼此自由移动并 且在分泌/制造期间独立适当折叠。当需要确保两个相邻结构域不空间干扰彼此时，使用 较长连接子。
[0058] 旁系同源物、直系同源物以及同源物
[0059] 术语"旁系同源物"被理解为由于共有的世系、接着一个或多个复制事件而共有一 些程度的同源性的蛋白质或基因。旁系同源物是通过在一种基因组内复制而相关的基因， 而直系同源物是不同物种中通过物种形成从一种共同上代基因演化的同源基因。术语同源 物适用于通过物种形成的事件分离的基因之间的关系（直系同源物）或通过遗传复制的事 件分离的基因之间的关系（旁系同源物）。
[0060] 类似物
[0061] 术语序列类似物意指结构上并且免疫原性上类似于彼此但氨基酸组成不同的多 肽。
[0062] 疫苗
[0063] 本发明的另一部分涉及一种疫苗组合物，包含一种根据本发明的融合蛋白。在用 一种毒性分枝杆菌攻击之后，其中一种本发明融合蛋白由动物识别的一种有效疫苗在一种 动物模型中与未被接种疫苗的动物相比将能够降低标靶器官中细菌负荷、延长存活时间和 /或减小体重减轻。
[0064] 为了确保这种疫苗组合物的最优性能，优选的是它包含一种免疫学上和药学上可 接受的载剂、媒剂或佐剂。
[0065] 适合载剂选自下组，该组由以下各项组成：一种或多种多肽通过疏水非共价相互 作用而结合的一种聚合物，如一种塑料，例如聚苯乙烯；或一种或多种多肽共价结合的一种 聚合物，如一种多糖或一种多肽，例如牛血清白蛋白、卵白蛋白或钥孔贝血蓝蛋白。适合媒 剂选自下组，该组由以下各项组成：一种稀释剂和一种悬浮剂。佐剂优选地选自下组，该组 由以下各项组成：阳离子脂质体（例如二甲基二（十八烷基）溴化铵（DDA))、Quil A、聚 I: C、氢氧化铝、弗氏不完全佐剂、IFN- γ、IL-2、IL-12、单磷酰脂质A (MPL)、海藻糖二霉菌酸 酯（TDM)、海藻糖二山嵛酸酯（TDB)、胞壁酰二肽（MDP)以及单霉菌醇甘油（MMG)或其组合。
[0066] 实现用于疫苗的佐剂效应的其他方法包括使用药剂，如氢氧化铝或磷酸铝（矾）、 糖的合成聚合物（Carbopol);通过热处理使蛋白质在疫苗中聚集；通过用针对白蛋白的被 胃蛋白酶处理的（Fab)抗体再活化而聚集；还可以使用与革兰氏阴性细菌的细菌细胞（如 微小隐孢子虫）或内毒素或脂多糖组分的混合物、生理学上可接受的油媒剂（如二缩甘露 醇单油酸酯（Aracel A))中的乳液或具有20%全氟化碳溶液（Fluosol-DA)用作一种封闭 取代物的乳液。其他可能性涉及使用免疫调节物质，如细胞因子或合成IFN-γ诱导剂，如 聚I :C，与以上提及的佐剂组合。
[0067] 用于实现佐剂效应的另一种令人感兴趣的可能性是使用戈瑟兰（Gosselin)等 人，1992 (它特