rv3619c)以及五种 CFPlO 旁系同源物 esxJ(rvl038c)、esxK(rvll97)、 esxP(rv2347c)、esxW(rv3620c)的分泌。在海分枝杆菌中，ESX-5介导的蛋白质分泌的功能 是建立一种中度并且持续的感染 31。ESX-5不足的海分枝杆菌是高毒性的，ESX-5还见于结 核分枝杆菌中。
[0104] ESX-2和ESX-4的功能保持未知的，但基于与其他ESX分泌系统的功能和物理同源 性，它们有可能对应地分泌esxC-esxD和esxT-esxU复合体。
[0105] 因为ESAT-6家族蛋白质在一种结核分枝杆菌感染期间是高度表达的，是高度 免疫原性的，并且实验数据支持其在疫苗接种之后的保护性功效 32'33,所以我们基于六种 ESAT-6家族蛋白质构筑H65融合蛋白。为了使得疫苗与当前诊断测试相容，不包括最突出 的家族成员ESAT-6和CFP10。
[0106] H65 融合体中的 ESAT-6 蛋白质的顺序是：Rv3891c-Rv3890c-Rv0287-Rv0288-Rv 3620c-RV3619c，但可以使用任何顺序。在3个蛋白偶联中的每一者之间，插入9氨基酸 GLVPRGSTG连接子序列以允许蛋白质折叠和二聚体形成。在Rv3890c与Rv0287之间插入 20氨基酸LIGAHPRALNWKFGGAAFL连接子，并且在Rv0288与Rv3630c之间插入20氨基酸 LGFGAGRLRGLFTNPGSWRI连接子。两种20氨基酸连接子的序列都来自Rvl886结核分枝杆菌 HRv37蛋白质序列并且对应于这种蛋白质中的氨基酸位置61-80和161-18034。包括这些连 接子，因为它们已经显示是人类表位并且因为T细胞响应于这些连接子分泌大量细胞因子 IL-2。IL-2为T细胞变成效应T细胞的生长、增殖以及分化所需。除了增加疫苗诱导的T 细胞池的多样性之外，这些IL-2分泌性T细胞可以提供细胞因子，有助于其他T细胞在其 分化中从原始成为效应T细胞。
[0107] H72 融合体中的 ESAT-6 蛋白质的顺序是：Rv3616c-Rv3615c-Rv3620c-Rv3619c-Rv 0287-Rv0288-，但可以使用任何顺序。
[0108] H73 融合体中的 ESAT-6 蛋白质的顺序是 Rv3881c-Rv3616c-Rv3615c-Rv3620c-Rv3 619c-Rv0287-Rv0288-，但可以使用任何顺序。
[0109] H67 :包含一种潜伏多肽的一种融合蛋白Ag85B-ESAT6-Rvl284
[0110] Hl疫苗，Ag85B与ESAT-6的一种蛋白质融合体（Ag85B-ESAT6)是一种非常高效的 针对一种初次感染的疫苗，但归因于两种抗原的表达谱，它在感染的较早阶段期间具有其 初始效应。为了开发在早期和晚期感染（持续和从潜伏期再活化）两者中都有效的一种疫 苗，使Hl融合蛋白富集有Rvl284。表达研宄已经显示，Rvl284在模拟晚期感染的体外条件 下强表达。因此通过添加 Rvl284,应可能不仅增加 Hl在早期感染阶段中的保护性功效，而 且将功效延伸到感染的后期。
[0111] 我们基于Ag85B、ESAT-6以及R1284设计H67融合蛋白，它反映蛋白质的顺序，但 可以使用任何多肽顺序。H67由549个氨基酸组成，理论分子量是59548g/mol，并且等电点 5. 36。在从结核分枝杆菌染色体编码的野生型序列中，在Ag85B中存在三个半胱氨酸，并且 在Rvl284中存在三个半胱氨酸。为在再折叠期间避免硫桥形成和蛋白质聚集的问题，全部 三个半胱氨酸都已经被氨基酸丝氨酸置换。
[0112] 关于H67中的单个蛋白质的信息：
[0113] Ar85B(Rv1886c)是霉菌醇转移酶85B，一种细胞外蛋白质，并且选择为融合蛋白 中的最具免疫原性的蛋白质，特征在于Ag85B表达有一个初始瞬态增加，但在10天感染之 后细菌Ag85B表达的水平已经下降约15倍/CFU，并且这种低水平在感染后维持至少多达 100 天 35〇
[0114] ESAT-6 (Rv3875)与CFPlO -起经由ESX-1以一种异源二聚体形式分泌。ESX-1底 物ESAT-6在感染期间不同时间点展示高表达并且显示出高免疫原性。
[0115] Rvl284编码一种β -碳酸酐酶，并且该基因已经显示为结核分枝杆菌所必需。基 因的表达先前已经报告在营养饥饿的培养物中的14到40倍增加36。
[0116]
【主权项】
1. 一种融合蛋白或抗原混合物，它包含选自以下的氨基酸序列： (a) SEQ ID NO. I(ESAT6),SEQ ID NO 2(Rv3614c),SEQ ID NO 3(Rv3615c),SEQ ID NO 4(Rv3865)、SEQ ID NO 5(Rv3849)以及 SEQ ID NO 6(Rv3872)，或 (b) SEQ ID NO 2(Rv3614c)、SEQ ID NO 3(Rv3615c)、SEQ ID NO 4(Rv3865)、SEQ ID NO 5 (Rv3849)以及 SEQ ID NO 6 (Rv3872)，或 (c) SEQ ID NO 2(Rv3614c)、SEQ ID NO 3(Rv3615c)、SEQ ID NO 4(Rv3865)、SEQ ID NO 5(Rv3849)、SEQ ID NO 6(Rv3872)以及 SEQ ID NO 7(Rv3616c)，或 (d) SEQ ID NO 2(Rv3614c)、SEQ ID NO 3(Rv3615c)、SEQ ID NO 4(Rv3865)、SEQ ID NO 5(Rv3849)、SEQ ID NO 6(Rv3872)、SEQ ID N07(Rv3616c)以及 SEQ ID NO 8(Rv3881c)，或 (e) SEQ ID NO 2(Rv3614c)、SEQ ID NO 3(Rv3615c)、SEQ ID NO 4(Rv3865)、SEQ ID NO 5(Rv3849)、SEQ ID NO 6(Rv3872)以及 SEQ ID NO 8(Rv3881c)，或 (f) SEQ ID NO 9(Rv3891c), SEQ ID NO 10(Rv3890), SEQ ID NO ll(Rv0287), SEQ ID NO 12(Rv0288)、SEQ ID NO 13(Rv3620c)以及 SEQ ID NO 14(Rv3619)，或 (g) SEQ ID NO ll(Rv0287)、SEQ ID NO 12(Rv0288)、SEQ ID NO 13(Rv3620c)、SEQ ID NO 14(Rv3619)、N0 7(Rv3616c)以及 SEQ ID N03(Rv3615c)，或 (h) SEQ ID NO ll(Rv0287)、SEQ ID NO 12(Rv0288)、SEQ ID NO 13(Rv3620c)、SEQ ID NO 14(Rv3619)、N0 7(Rv3616c)、SEQ ID NO 3(Rv3615c)以及 SEQ ID 9(Rv3881c)，或 (i) SEQ ID NO 1(ESAT6)、SEQ ID NO 15(Ag85B)和 SEQ ID NO 16(Rvl284)，或 (j) 与（a)-(i)中的序列中的任一者具有至少80%序列一致性并且同时具有免疫原性 的氨基酸序列类似物。
2. 根据权利要求1所述的融合蛋白或抗原混合物，其中该氨基酸序列类似物与（a)、 (b)、（c)、（d)、（e)、（f)、（g)、(h)或⑴中的序列具有至少90%或更优选95%序列一致性。
3. 根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中半胱氨酸已经被另一种氨基酸置换以避 免硫桥形成和蛋白质聚集。
4. 根据权利要求3所述的融合蛋白，其中该半胱氨酸已经被丝氨酸置换。
5. 根据权利要求1-4所述的融合蛋白，其中融合伴侣与一个连接子分子连接。
6. 根据权利要求5所述的融合蛋白，它具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO 18 (H64)、SEQ ID NO 19 (H68)、SEQ ID NO 20 (H69)、SEQ ID NO 21 (H70)、SEQ ID NO 22(H71)、SEQ ID NO 23(H65)、SEQ ID N024(H72)、SEQ ID NO 25(H73)或 SEQ ID NO 26(H67)。
7. 根据权利要求1-2所述的抗原混合物，其中该混合物包含SEQ ID N016和SEQ ID NO 17。
8. 根据以上权利要求中任一项所述的融合蛋白或抗原混合物的用途，它用于制备用于 针对由毒性分枝杆菌，例如由结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌或牛分枝杆菌造成的感染进行 疫苗接种的药物组合物。
9. 一种疫苗，包含根据权利要求1到6所述的融合蛋白或抗原混合物。
10. 根据权利要求8所述的疫苗，另外包含佐剂。
11. 根据权利要求9所述的疫苗，其中该佐剂选自下组，该组由以下各项组成：阳离子 脂质体（例如一甲基一(十八烷基）漠化按（DDA))、Quil A、聚I: C、氣氧化错、弗氏不完全 佐剂、IFN-Y、IL-2、IL-12、单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯（TDM)、海藻糖二山嵛酸 酯（TDB)、胞壁酰二肽（MDP)以及单霉菌醇甘油（MMG)或其组合。
12. -种用于使动物、包括人类，针对由毒性分枝杆菌，例如由结核分枝杆菌、非洲分枝 杆菌或牛分枝杆菌造成的结核免疫的方法，包括向该动物给予根据权利要求8-10中任一 项所述的疫苗。
【专利摘要】本发明针对：针对由毒性分枝杆菌，例如由结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、坎纳分枝杆菌、鳍足动物分枝杆菌或曼奇分枝杆菌造成的感染的融合蛋白、抗原混合物以及免疫组合物，如疫苗。这些融合蛋白或抗原混合物是基于ESX分泌性的或相关的蛋白质，例如由ESAT-6分泌系统1(ESX-1)分泌的蛋白质，它们属于最免疫显性的结核分枝杆菌(MTB)抗原之中。
【IPC分类】A61K38-00, A61K39-00, C07K14-35
【公开号】CN104736555
【申请号】CN201380054841
【发明人】克劳斯·埃格德, 艾达·罗森克兰达斯, 特吕克·蒂·吉姆·坦·候昂, 彼得·安德森
【申请人】国立血清研究所
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2013年10月18日
【公告号】EP2912056A2, WO2014063704A2, WO2014063704A3, WO2014063704A8