号小麦的DNA为模板扩增出小麦CAD基因的第二内含子序列，具体操作请参照 常规的扩增步骤。
[0043] 在步骤2)中，所扩增的片段大小在lOOObp左右，该扩增片段的电泳图谱见图4,从 该图中可见，该引物能有效扩增，从该图中可见扩增后的条带大小为lOOObp左右，与预计 大小一致，用上海普洛麦格公司的PCR回收试剂盒切胶回收送测序，该片段的序列见序列 表中的SEQN0. 11所示，序列长度为981bp。
[0044] 3)根据步骤1)中的比对结果，经过同源序列比对，设计一对扩增引物， 其中上游引物KL3F2为：5' -GAGCGTGCATCACTITTAGC-3'；下游引物KL3R2为： 5'-CGGTGTCGATGATGTAGTCC-3'，用该引物，红皖3号小麦的DNA为模板扩增出小麦CAD基因 的第三内含子序列，具体操作请参照常规的扩增步骤。
[0045] 在步骤3)中，所扩增的片段大小在1500bp左右，该扩增片段的电泳图谱见图5,从 该图中可见，该引物能有效扩增，从该图中可见扩增后的条带大小为1300bp左右，与预计 大小一致，用上海普洛麦格公司的PCR回收试剂盒切胶回收送测序，该片段的序列见序列 表中的SEQN0. 12所示，序列长度为1442bp。
[0046] 4)将上述扩增出的三个内含子拼接，在拼接全长的首尾端设计一对扩 增引物，该引物由两条单链寡聚核苷酸组成，其中上游引物QCF3有18个碱基： 5' -CCTCCCAAATCCACGCAT-3'，下游引物QCR3 有 20 个碱基：5' -CAAGITCAGGCAAATGCCAC-3， 该引物通过长PCR扩增方法扩增出小麦CAD基因DNA序列全长，该片段的电泳结果见图6， 从该图中可见，该引物能有效扩增，从该图中可见扩增后的条带大小为5000bp左右，与预 计大小一致，该片段中包括第一内含子、第二内含子和第三内含子序列，将上述扩增产物切 胶回收，纯化后送测序；
[0047] 在步骤4)中，所述长PCR方法的具体步骤为：
[0048] (1)配置PCR反应体系，体系为20y1反应体系。其中，10XPCRBuffer2yl，dNTP Mixture3.2yl，引物QCF3(10yM)和QCR3(10yM)各 0.5yl，Taq酶 0.2yl，红皖 3 号 小麦的DNA50ng加入PCR板中，加水至20y1，混匀后滴加石蜡油1滴防止蒸发。
[0049] (2)对上述PCR反应液进行PCR循环。
[0050]第一步：95°C变形 5min;第二步：63°C变性 50s，63°C退火 40s，72°C延伸 5min;第 二步重复35-38次；第三步：72°C延伸30min;第四步：4°C保存。
[0051] 在上述扩增过程中，由于所扩增产物片段较长，对PCR反应条件进行了调整。包括 使用TAKAR公司生产的长链PCR专用的LATaq酶代替普通的Taq酶；变性温度采用63°C; 延伸时间增加到5min。实验证明这些调整都有助于提高PCR的成功率和产率。
[0052] 5)对所得的扩增产物，用上海普洛麦格公司的PCR回收试剂盒切胶回收送测序， 该片段的序列见序列表中的SEQN0. 9所示，该片段全长4317bp，包括了三个内含子序列。
[0053] 使用序列比对软件DNAMAN对所得的小麦CAD基因DNA序列和已知的cDNA序列比 对，比对结果见图7-1和图7-2,从图中可找出小麦CAD基因中的第一、二和三个内含子序 列，且三个内含子序列长度分别为20066?、3976?、7476?。测序结果与小麦(^嫩序列和其他 同源物种序列的比较，证实测得的序列是小麦CAD基因DNA序列全长，为小麦分子辅助育种 提供了重要的研宄价值。
【主权项】
1. 一种小麦肉桂醇脱氢酶基因DNA序列扩增方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 将小麦的肉桂醇脱氢酶基因的cDNA序列与其近缘物种的肉桂醇脱氢酶基因的DNA 序列进行比对，得到肉桂醇脱氢酶基因的保守区域序列，设计一对扩增引物，扩增其中的第 一内含子序列； 2) 根据步骤1)中获得的比对结果，设计一对扩增引物，扩增其中的第二内含子序列； 3) 根据步骤1)中获得的比对结果，设计一对扩增引物，扩增其中的第三内含子序列； 4) 将上述扩增出的三个内含子拼接，在拼接全长的首尾端设计一对扩增引物，通过长 PCR扩增方法扩增出小麦肉桂醇脱氢酶基因DNA序列全长，将上述扩增产物切胶回收，纯化 后测序检测。
2. 根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，步骤1)~3)中所述的小麦近缘物种 选自玉米、水稻、大麦、黑麦草或高粱中的至少一种。
3. 根据权利要求1或2所述的扩增方法，其特征在于，步骤1)中设计得到的扩增引物 序列如下1)或2): 1) 序列表中SEQ NO. 1和SEQ NO. 2所示的序列； 2) 将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有 与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。
4. 根据权利要求1或2所述的扩增方法，其特征在于，步骤2)中设计得到的扩增引物 序列如下1)或2): 1) 序列表中SEQ NO. 3和SEQ NO. 4所示的序列； 2) 将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有 与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。
5. 根据权利要求1或2所述的扩增方法，其特征在于，步骤3)中设计得到的扩增引物 序列如下1)或2): 1) 序列表中SEQ NO. 5和SEQ NO. 6所示的序列； 2) 将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有 与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。
6. 根据权利要求1或2所述的扩增方法，其特征在于，步骤4)中设计得到的扩增引物 序列如下1)或2): 1) 序列表中SEQ NO. 7和SEQ NO. 8所示的序列； 2) 将所述1)的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有 与1)中的核苷酸序列具有同样功能的核苷酸序列。
7. 通过权利要求1所述的扩增方法所得到的小麦肉桂醇脱氢酶基因DNA序列全长。
8. 根据权利要求7所述的DNA序列全长，其特征在于，其序列如序列表中SEQ NO. 9所 示的序列。
9. 权利要求7所述的小麦肉桂醇脱氢酶基因DNA序列全长在筛选抗倒伏小麦分子育种 上的应用。
10. 权利要求7所述的小麦肉桂醇脱氢酶基因DNA序列全长在制备抗倒伏转基因小麦 上的应用。
【专利摘要】本发明提供了小麦肉桂醇脱氢酶基因DNA序列扩增方法及其引物，其方法包括如下步骤：1)将小麦的肉桂醇脱氢酶基因的cDNA序列与其近缘物种的肉桂醇脱氢酶基因的DNA序列进行比对，得到肉桂醇脱氢酶基因的保守区域序列，设计一对扩增引物，扩增其中的第一内含子序列；2)根据步骤1)中获得的比对结果，设计一对扩增引物，扩增其中的第二内含子序列；3)根据步骤1)中获得的比对结果，设计一对扩增引物，扩增其中的第三内含子序列；4)将上述扩增出的三个内含子拼接，在拼接全长的首尾端设计一对扩增引物，通过长PCR扩增方法扩增出小麦肉桂醇脱氢酶基因DNA序列全长，将上述扩增产物切胶回收，纯化后测序检测。该方法能有效扩增出CAD基因全长。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-53, A01H5-00, C12N15-10
【公开号】CN104745573
【申请号】CN201510205775
【发明人】刘怡, 司红起, 郭小浩, 常井明
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月27日