r>[0040]3)分群体取样，提取DNA
[0041]根据遗传分析的结果及调查所得的相对性状把F2代分为以相对性状为依据的两个群体，提取其中显性性状样本的DNA作为主要实验样品，隐性性状样本作为辅助实验样本。
[0042]如图5所示，本发明实施例提供了一种针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，包括如下步骤:
[0043]S1、亲本初筛引物(使用普通PCR及PAGE方法)
[0044]以两个亲本分别建池后的基因池DNA样品作为待研宄相对性状的样品，另外再选取一个与两个亲本没有共同遗传背景的品种或品系，建立基因池，取其作为对照DNA样品，这样即构建成立3个样品组成的亲本初筛模板，以两对基因互补为例，那么这个互补产生的性状的显性基因每个亲本分别一个。
[0045]以上述构建的3个初筛模板，按照SSR (简单重复序列)引物所在染色体分类，批量筛选。具体方法就是按照相应引物的退火温度做SSR-PCR，然后把PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，按照同一个引物的3个不模板为一组，以不同引物不同组的先后顺序点样，其参考PAGE胶图如图1所示，然后分析每一组即相同引物的3个样品之间的带型差异，进而筛选出在两亲本间有差异的SSR引物，以便进一步筛选验证。
[0046]S2、16个显性性状含亲本小群体复筛(使用普通PCR及PAGE方法)
[0047]a.构建16个样品小群体
[0048]随机选取13个明显具有显性性状主要实验样品个体的DNA样品，加上两个亲本分别建池后的基因池DNA样品，另外再选取一个与两个亲本没有共同遗传背景的品种或品系，建立基因池，取其作为对照DNA样品，共同组成16个样品的小群体。
[0049]b.实验分析筛选疑似标记
[0050]以此16个样品小群体为模板做SSR-PCR，然后用PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，其参考PAGE胶图如图2所示，分析同一引物对应的样本组内目的条带的差异，选取在亲本中有差异，在13个F2样本之中主要目的条带只有< 2个与具有隐性条带亲本的条带一致，其余至少11个样品的主要目的条带均保持与具有显性条带的亲本一致或具有杂合条带的引物作为疑似标记进入下一轮筛选。
[0051]S3、38个显性性状含亲本小群体验证复筛结果(使用普通PCR及PAGE方法)
[0052]a.构建38个样品小群体
[0053]随机选取不同于前述2中13个样品的另外的35个明显具有显性性状主要实验样品个体的DNA样品，加上两个亲本分别建池后的基因池DNA样品，另外再选取一个与两个亲本没有共同遗传背景的品种或品系，建立基因池，取其作为对照DNA样品，共同组成38个样品的小群体。
[0054]b.实验分析验证复筛出的疑似标记
[0055]以此38个样品小群体为模板进行SSR-PCR，然后用PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析同一引物对应的样本组内目的条带的差异，其参考PAGE胶图如图3所示，选取表现为在亲本中有差异，在35个F2样本之中主要目的条带只有< 3个有差异，其余至少32个样品的目的条带均保持一致，即在包括复筛13个F2样品在内的48个F2样品中只有^5个样品有差异目的条带的引物作为疑似标记进入下一轮筛选。
[0056]S4、24个隐性性状含亲本小群体重复验证复筛结果(使用普通PCR及PAGE方法)
[0057]a.构建24个样品小群体
[0058]随机选取21个明显具有阴性性状主要实验样品个体的DNA样品，加上两个亲本分别建池后的基因池DNA样品，另外再选取一个与两个亲本没有共同遗传背景的品种或品系，建立基因池，取其作为对照DNA样品，共同组成24个样品的小群体。
[0059]b.实验分析验证复筛出的疑似标记
[0060]以此24个样品小群体为模板进行SSR-PCR，然后用PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析同一引物对应的样本组内目的条带的差异，其参考PAGE胶图如图4所示，以两对基因显性互补为例，理论上对隐性性状群体而言，任何一对基因显性带型:隐性带型=3: 4，考虑到采样等多种因素的影响，又因为此步骤只是作为辅证，显隐性带型的分离比在隐性性状群体中和在显性性状群体中具有显著差异即可，所以在21个隐性性状群体中，有不少于5个且小于15个隐性带型即可保留此引物，然后准备进一步用扩大了的显性性状群体验证。
[0061]S5、初步确定目标基因所在染色体，集中筛选预备标记；
[0062]分析通过上述1-4步筛出的SSR标记，会有多个标记集中在同一染色体上，这样就初步断定目标基因所在的染色体，然后集中筛选此染色体上对应的SSR标记，选出足够多的标记以便之后上群体验证并作图。
[0063]S6、对另外互补的基因利用上述方法进行筛选；具体流程同1-5步。
[0064]两对以上互补基因虽然具体遗传分离比仍要具体计算，但也可以一对一对基因依次按照1-5步重复操作，具体方法步骤类似。
[0065]S7、群体验证筛出的互补作用的基因的分子标记，定位出基因并作出遗传图谱。
[0066]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，其特征在于，包括如下步骤: 51、构建3个初筛模板，按照相应引物的退火温度做SSR-PCR，然后把PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳，按照同一个引物的3个不同模板为一组，以不同引物不同组的先后顺序点样，然后分析每一组即相同引物的3个样品之间的带型差异，进而筛选出在两亲本间有差异的SSR引物，以便进一步筛选验证； 52、构建16个样品小群体，并以此为模板做SSR-PCR，然后用PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析同一引物对应的样本组内目的条带的差异，选取符合在此群体中约定规律的引物作为疑似标记进入下一轮筛选； 53、构建38个样品小群体，并以此为模板进行SSR-PCR，然后用PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析同一引物对应的样本组内目的条带的差异，选取符合在此群体中约定规律的引物作为疑似标记进入下一轮筛选； 54、构建24个样品小群体，并以此为模板进行SSR-PCR，然后用PCR产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析同一引物对应的样本组内目的条带的差异，保留在21个隐性性状群体中，有不少于5个且小于15个隐性带型的引物，然后准备进一步用扩大了的显性性状群体验证； 55、初步确定目标基因所在染色体，集中筛选预备标记； 56、对另外互补的基因利用上述方法进行筛选； 57、群体筛出的互补作用的基因的分子标记，定位出基因并作出遗传图谱。
2.根据权利要求1所述的针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，其特征在于，所述步骤SI中初筛模板的构建方法为:以两个亲本分别建池后的基因池DNA样品作为待研宄相对性状的样品，另外再选取一个与两个亲本没有共同遗传背景的品种或品系，建立基因池，取其作为对照DNA样品。
3.根据权利要求1所述的针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，其特征在于，所述步骤S2中选取的在13个F2样本之中主要目的条带只有< 2个与具有隐性条带亲本的条带一致，其余至少11个样品的主要目的条带均保持与具有显性条带的亲本一致或具有杂合条带的引物作为疑似标记。
4.根据权利要求1所述的针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，其特征在于，所述步骤S3中选取在35个F2样本之中主要目的条带只有< 3个有差异，其余至少32个样品的目的条带均保持一致，或在包括复筛时的13个F2样品在内的48个F2样品中只有< 5个样品有差异目的条带的作为疑似标记。
5.根据权利要求1所述的针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，其特征在于，所述步骤S4的作用是以隐性性状样本作为对照，用以从反面辅证S2、S3中所筛选出引物的可靠性。
6.根据权利要求1所述的针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，其特征在于，所述步骤S5的具体方法为:分析上述S1-S4步筛出的SSR标记，有多个标记集中在同一染色体上，初步断定此染色体为目标基因所在的染色体，然后集中筛选此染色体上对应的SSR标记，选出足够多的标记以便之后上群体验证并作图。
7.根据权利要求1所述的针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，其特征在于，所述步骤S6中对另外互补的基因进行初步筛选的方法为:以一对一对基因依次重复步 骤 S1-S5。
【专利摘要】本发明公开了一种针对互补作用质量性状基因的分子标记筛选方法，包括如下步骤：构建3个初筛模板，进行亲本初筛引物；构建16个样品小群体，进行亲本间有差异引物的复筛，符合约定规律的引物作为疑似标记进入下一轮筛选；构建38个样品小群体，选取目的条带在此群体中符合约定规律的引物作为疑似标记进入下一轮筛选；构建24个样品小群体，保留在此群体中符合约定规律的标记；初步确定目标基因所在染色体，集中筛选预备标记；对另外互补的基因利用如上方法进行筛选；群体验证筛出的互补作用的基因的分子标记，定位并作出遗传图谱。本发明结合SSR等分子标记使用，使此类二或多对基因互补产生的质量性状的基因的分子标记筛选变得相对简单易行。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104762395
【申请号】CN201510173731
【发明人】吉万全, 张宏, 吕士凯, 王艳珍, 王长有, 王亚娟, 张荣琦, 刘新
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月10日