[0021] 实施例1结核分枝杆菌分泌蛋白PtpA的泛素结合结构域（UIML结构域）
[0022] 结核分枝杆菌分泌蛋白PtpA与泛素相互作用的结构域，其氨基酸序列为：
[0023] PRSGTHALDVEDPYYGDHSDFEEVFAVIESALPGLHDWVDERLARNG。HML 结构域及其结构类 似物可用于抗结核药物的筛选。
[0024] PtpA HML结构域蛋白的制备方法是构建含有PtpA HML结构域基因的重 组质粒pGEX-6P-1-PtpA-UML，并将质粒转化到大肠杆菌BL21中，用IPTG在30 °C条 件下诱导蛋白表达；超声破菌，高速离心后收取上清液；将上清液缓缓流过填充好的 Glutathione-Sepharosebeads (GE)中，然后加入柱洗漆缓冲液充分洗漆柱子，最后加 入2-3ml洗脱液洗脱蛋白；将收集的洗脱液加入到IOKD的蛋白浓缩管（millipore)中， 3500rpm离心浓缩20分钟；在蛋白浓缩管中加入2mlPBS混匀后离心；分装蛋白，-80°C保存 待用。
[0025] 实施例2结核分枝杆菌分泌蛋白PtpAHML结构域与泛素直接相互作用
[0026] 通过对已知的PtpA和Ub蛋白的晶体结构分析发现PtpA蛋白中存在一段类似于 真核UIM结构域的一段氨基酸序列（UIML结构域）（图1)，因为该序列中存在一段类似于真 核UIM结构域的疏水氨基酸序列，我们认为该结构域可能与泛素的相互作用有关，是我们 首次发现的原核ΠΜ结构域。该WML结构域与目前已经报道的真核ΠΜ结构域并不具有 一致性，是我们在原核蛋白中首次发现的。同时通过晶体结构分析我们认为A140位点可能 是PtpA蛋白与泛素疏水相互作用的关键位点。
[0027] 通过体外实验，将A140位点突变的PtpA (A140E)蛋白和野生型的PtpA蛋白分别 与泛素进行Pull down实验，结果表明PtpA (A140E)的确丧失了与Ub的相互作用（图2A)。
[0028] 进一步纯化了含有PtpA HML结构域及A140位突变的PtpA HML(AHOE)结构域 蛋白，同样将这两个蛋白分别与泛素进行体外PulI down实验，结果证明WML结构域可以与 泛素直接相互作用，当该结构域中的140位丙氨酸（A)突变为谷氨酸（E)时，该结构域丧失 与泛素的相互作用（图2B)。我们推测Ub可能通过与PtpA蛋白相互作用从而改变了 PtpA 的空间构象导致其酶活提高，具体原因目前尚不清楚。
[0029] WML结构域中的第140位丙氨酸是其与泛素结合的关键位点之一，但不排除该结 构域中还存在其它影响泛素结合或PtpA磷酸酶活性的关键位点。
[0030] 实施例3泛素丧失对磷酸酯酶PtpA (A140E)突变体酶活的调控能力
[0031] 在中国发明专利申请201310466907. 2记载了 Ub对于PtpA的磷酸酯酶活性有很 强的激活作用，从而增强其将底物P-JNK、p-P38去磷酸化的活力。
[0032] 进行同样的酶活实验后我们发现，由于PtpA (A140E)丧失了与泛素相互作用的能 力，所以其磷酸酯酶活性不再受到泛素调控（图3)。同样在体外的去磷酸反应中，我们也得 到了同样的结果，即PtpA (A140E)对底物p-JNK、p-P38的去磷酸化活性也不再受到泛素的 调控（图4)。
[0033] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种结核分枝杆菌分泌蛋白的泛素结合结构域，其特征在于，氨基酸序列如（a)或 (b)或（c): (a) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列； (b )在（a )中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有泛素 结合结构域功能的由（a)衍生的多肽或其类似物； (c)与（a)、（b)中氨基酸序列整体相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其类似物。
2. 根据权利要求1所述的泛素结合结构域，其特征在于，所述结核分枝杆菌分泌蛋白 是PtpA蛋白，其氣基酸序列如SEQ ID NO. 2所不。
3. 根据权利要求2所述的泛素结合结构域，其特征在于，是从PtpA蛋白的第115位氨 基酸到第161位氨基酸，其中，第136-145位的疏水氨基酸序列EEVFAVIESA能与泛素发生 疏水相互作用。
4. 一种权利要求1所述泛素结合结构域的关键位点，其特征在于，是所述结合结构域 的A26位点，该位点是泛素与结核分枝杆菌分泌蛋白结合并调控其磷酸酯酶活性的关键位 点。
5. -种制备权利要求1所述泛素结合结构域的方法，其特征在于，是将编码所述结构 域的基因连接到载体PGEX-6P-1，得到重组质粒pGEX-6P-1-PtpA-UML ;将重组质粒转化到 大肠杆菌BL21中，用IPTG在30°C条件下诱导蛋白表达；超声破菌、高速离心后收取上清 液；将上清液纯化浓缩得到泛素结合结构域蛋白。
6. 权利要求1所述泛素结合结构域在制备抗结核药物和新型疫苗中的应用。
7. 权利要求1所述泛素结合结构域在制备调控JNK和P38的磷酸化水平的药物中的应 用。
8. 权利要求4所述关键位点在制备抗结核药物和新型疫苗中的应用。
9. 权利要求4所述关键位点在制备调控JNK和P38的磷酸化水平的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种结核分枝杆菌分泌蛋白的泛素结合结构域，属于细胞生物学领域。本发明首次确定了PtpA的泛素蛋白结合结构域及其关键结合位点（A140），所述泛素结合结构域是从PtpA蛋白的第115位氨基酸到第161位氨基酸，其中，疏水氨基酸序列EEVFAVIESA（136-145）能够与泛素发生疏水相互作用。当UIML结构域的A140位点发生突变可导致Ub与PtpA结合能力及其酶活调控功能的丧失。本发明成果为基于PtpA分子的抗结核药物筛选和疫苗开发提供了特异性序列，为临床多种疾病的治疗提供新的工具和思路，尤其在抗肿瘤等多种药物的开发和临床应用等方面将有着广阔的前景，也可以直接应用于科研领域或指导开发可逆性调控JNK和P38信号通路的制剂。
【IPC分类】G01N33-68, C12R1-32, A61K45-00, A61P31-06, C12N9-16, C12N15-70
【公开号】CN104862289
【申请号】CN201410061782
【发明人】刘翠华, 汪静, 李冰曦, 鲁燕
【申请人】中国科学院微生物研究所
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2014年2月24日