:5，培养基加水量70-80%(v/w)，培养基初始pH自然；接种蛹虫草液体种子量为培养基干重的10% (v/w)?
[0030]培养条件:23 °C恒温恒湿培养时间4d。
[0031]实施例3
1、菌种:同实施例1。
[0032]、培养基及培养条件:
(I)斜面培养同实施例1。
[0033]( 2 )平板培养同实施例1。
[0034](3)液体种子培养基:20%马铃薯汁，2%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.1%磷酸二氢钾，
0.05%硫酸镁，pH自然，接菌量为直径1mm的菌苔圆片一片。
[0035]培养条件:23°C，180r/min培养4d。
[0036](4)固体发酵培养基:由大米和麸皮组成，比例为3:5，培养基加水量70-80%(v/w)，培养基初始pH自然；接种蛹虫草液体种子量为培养基干重的10% (v/w)?
[0037]培养条件:23 °C恒温恒湿培养时间4d。
[0038]实施例4
1、菌种:同实施例1。
[0039]、培养基及培养条件:
(I)斜面培养同实施例1。
[0040]( 2 )平板培养同实施例1。
[0041](3)液体种子培养同实施例3。
[0042](4)固体发酵培养基:由大米和麸皮组成，比例为1:1，培养基加水量70-80%(v/w)，培养基初始pH自然；接种蛹虫草液体种子量为培养基干重的10% (v/w)?
[0043]培养条件:23 °C恒温恒湿培养时间4d。
[0044]实施例5
1、菌种:同实施例1。
[0045]、培养基及培养条件:
(I)斜面培养同实施例1。
[0046]( 2 )平板培养同实施例1。
[0047](3)液体种子培养同实施例3。
[0048](4)固体发酵培养基:由大米和麸皮组成，比例为1:1，培养基加水量70-80%(v/w)，培养基初始pH自然；接种蛹虫草液体种子量为培养基的25% (v/w)?
[0049]培养条件:23 °C恒温恒湿培养时间5d。
[0050]实施例6
1、菌种:同实施例1。
[0051]、培养基及培养条件:
(I)斜面培养同实施例1。
[0052](2 )平板培养同实施例1。
[0053](3)液体种子培养同实施例3。
[0054](4)固体发酵培养同实施例5。
[0055](5)蛹虫草纤溶酶纤溶活性证明:
采用血纤维蛋白平板法检验此酶对血纤维蛋白的溶解性。
[0056]血纤维蛋白平板含有血纤维蛋白原(市售的血纤维蛋白原中可能含有纤维蛋白)和凝血酶，可溶性纤维蛋白原在凝血酶作用形成纤维蛋白单体，血纤维蛋白单体自发缔结，多聚化形成可见的血纤维蛋白凝胶，将纤溶酶液加到此平板凝胶表面，经过短时间培养后该酶即将血纤维蛋白溶解，在平板凝胶表面形成肉眼可见的透明圈。
[0057]纤维蛋白平板的配制:以配制10个平板为例，将0.25 g琼脂糖溶于50 mL生理盐水中，置于45 °(:水浴保温25 min后，再加入200 U的凝血酶混匀；0.2 g牛血纤维蛋白原溶于巴比妥钠缓冲液(pH 7.8)，置于45 °C水浴中保温5min。分别取5 mL纤维蛋白原溶液和5 mL凝血酶溶液混合倒入平板(直径为9 cm)中，待凝固后放入4°C保存备用。
[0058]纤溶酶酶活标准曲线制备:用尿激酶作为标准品，将50000U/支的尿激酶用生理盐水分别稀释成30、25、20、15、10、5、lU/mL备用。取10 PL不同浓度的尿激酶标准品点在制备好的血纤维蛋白平板。每个浓度做3个平行，盖上后于37 °C培养箱中保温6h，量溶圈直径取平均值。以溶圈直径为X (cm)，酶活性为y (U/mL)所得回归方程为，R2=0.978。
[0059]纤溶酶粗酶液的制备:用10mL生理盐水浸泡培养结束后的发酵产物，室温浸提纤溶酶4h。在4°C、4500r/min条件下离心15min，收集上清液，即为粗酶液。
[0060]发酵液酶活测定:用微量移液器取粗酶液1PL点接于血纤维蛋白平板表面，重复点样三次，37°C保温6h后测定平板表面形成的透明溶圈直径，以生理盐水做对照，将直径平均值带入上述公式即可求得酶的活力。
【主权项】
1.一种固体培养蛹虫草菌同时生产蛹虫草菌丝体和纤溶酶的方法，其特征在于，所述蛹虫草为蛹虫草C.LSG-1，分类学命名为蛹虫草Cordyceps mi Ii tar is,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号:CGMCC N0.2577，保藏日期:2008年7月4曰。2.使用如权利要求1所述蛹虫草菌固体发酵联产蛹虫草菌丝体和纤溶酶的方法，其特征在于，是以微生物蛹虫草菌株C.LSG-1为菌种，依次经斜面培养基活化、平板培养、液体种子制备、固体发酵同时生产蛹虫草菌丝体和纤溶酶。3.一种如权利要求2所述的蛹虫草菌斜面培养基活化方法，其特征在于，培养基组成包括20%马铃薯汁、2.5%琼脂、1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.1%磷酸二氢钾、0.05%硫酸镁、pH自然，培养基灭菌、冷却后接种蛹虫草菌株C.LSG-1，在23°C培养15~20d。4.一种如权利要求2所述的蛹虫草菌平板培养方法，其特征在于，培养基组成包括20%马铃薯汁、2.5%琼脂、1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.1%磷酸二氢钾、0.05%硫酸镁、pH自然，培养基灭菌、冷却后接种斜面培养的蛹虫草菌株C.LSG-1，在23°C培养15~20d。5.一种如权利要求2所述的蛹虫草菌种子液制备方法，其特征在于，种子培养基包括20%马铃薯汁、2%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.1%磷酸二氢钾、0.05%硫酸镁、pH自然，培养基灭菌、冷却后接入直径约为1mm的平板培养的菌苔圆片一片，在23°C，170-180r/min条件下培养4d。6.—种如权利要求2所述的蛹虫草菌固体发酵同时生产蛹虫草菌丝体和纤溶酶的方法，其特征在于，固体发酵培养基由大米和麸皮组成，比例为1:1，培养基加水量70-80%(v/w)，培养基初始pH自然；接种蛹虫草液体种子量为培养基干重的25% (v/w)，23°C培养5d。
【专利摘要】本发明公开了一种同时生产蛹虫草菌丝体和纤溶酶的培制方法，使用的菌种蛹虫草菌株C.LSG-1，已由申请人于2008年7月4日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供了菌种保藏，保藏号为CGMCC No.2577，其分类学命名为蛹虫草Cordyceps militaris。所述培制方法的具体步骤包括菌种活化、种子培养液制备、固体发酵，固体发酵基质中富含蛹虫草菌丝体和纤溶酶，其中纤溶酶活力达到927.77U/g。该方法使用大米和麸皮为培养基质培养蛹虫草菌同时生产蛹虫草菌丝体和纤溶酶，菌种及生产原料均安全可靠，原料价廉易得，生产周期较传统栽培技术生产周期缩短了5/6，操作简便，易于实现。本发明为防治血栓栓塞症的保健食品的研发提供了新的思路和研究基础，为蛹虫草菌丝体的生产提供了一种新的途径。CGMCC No.257720080704
【IPC分类】C12R1/645, C12N1/14, C12N9/68
【公开号】CN104911169
【申请号】CN201510159992
【发明人】刘晓兰, 郑喜群, 邓永平, 王玉
【申请人】齐齐哈尔大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年4月7日