br>[0046] (3)离心，0°C，12000rpm，收集菌体。用pH为7. 4的浓度为67mmol/l的磷酸缓冲 液洗涤细胞两次，收集3L产酶培养液的湿菌体约36. 2g，保存于-20°C，以备后续酶转化使 用。
[0047] 3.全细胞酶转化巴豆甜菜碱制备L-肉碱
[0048] (1)称取湿菌体（干重量为16g/L)悬浮于100ml pH为7. 0的50mmol/l磷酸缓冲 液中，加入巴豆甜菜碱底物的浓度为20g/L。
[0049] (2)反应液置于37°C，220rpm进行酶转化。分时间段取样，每次离心分离的菌体重 复用到酶转化反应中。
[0050] (3)采用5, 5' -二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB)法测定L-肉碱的产量。酶转 化4小时后，上清液中L-肉碱的产量达到3. 71g/L。
[0051] 实施例2:
[0052] 1.产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌的构建
[0053] 步骤一：从大肠杆菌野生株BW25113的基因组上扩增caiB⑶片段，引物设计正 向为：5' -GGGCATATGGATCATCTACCCATGCC-3'（SEQ ID NO. 1);引物设计反向为：5' -ATTCTC GAGCAACCGTGAGCTATTACGCC-3'（SEQ ID NO. 9);步骤二：选择一个 IPTG 诱导启动子的质粒 pET28a为载体，在多克隆位点的Ndel/Xhol酶切位点插入caiB⑶片段，得到过表达质粒 pET28a-caiBCD ;步骤三：将过表达质粒pET-caiBCD转入大肠杆菌表达株BL21 (DE3)中，获 得基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-caiBCD;步骤四：从大肠杆菌W3110上扩出基因 caiF和 caiT，caiF 的正向和反向引物分别为：5'-CACGCCCAT ATGTGTGAAGGATATGTTGAAAAAC-3'（SE Q NO. 3)和 5'-CAGCTCGAGTTAACGACGCATACTCTTTGACAA-3'（SEQ NO. 4) 〇;caiT 的正向和反向 引物分别为：5' -GGGGAATTCATGAAGAATGAAAAGAGAAAAACGG-3'（SEQ NO. 5)和 5' -GCCAAGCTT TTAATCTTTCCAGTTCTGTTTCGCG-3'（SEQ NO. 6);步骤五：将 caiF 和 caiT 同时插入到 pACYCD 的Ndel/Xhol和EcoR I/Hind III位点，得到过表达质粒pACYCD-caiT-caiF ;步骤六：将过 表达质粒pACYCD-caiT-caiF转入大肠杆菌基因工程菌BL21 (DE3) /pET28a-caiBCD中，获得 产 L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌 BL21 (DE3V(pET28a-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)。
[0054] 2.大肠杆菌基因工程菌 BL21 (DE3) ApET28a-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)全细胞 酶源的制备
[0055] (1)配制产酶培养基：甘油10ml/L、蛋白胨5g/L、酵母粉15g/L、KH2P0 45g/L、 K2HP045g/L、富马酸钠4g/L以及巴豆甜菜碱4g/L，pH为6,灭菌。
[0056] (2)接种量1% (V/V)，将大肠杆菌基因工程菌逐级活化培养后，接于装有产酶培 养基的容器中，37°C条件下加 ImM IPTG有氧培养6小时。
[0057] (3)离心，10°C，8000rpm，收集菌体。用pH为7. 4的浓度为67mmol/l的磷酸缓冲 液洗涤细胞两次。
[0058] 3.全细胞酶转化巴豆甜菜碱制备L-肉碱
[0059] (1)将上述湿菌体（干重量为16g/L)悬浮于pH为7. 0的50mmol/l磷酸缓冲液 中，加入巴豆甜菜碱底物的浓度为20g/L。
[0060] (2)反应液置于37°C，220rpm进行酶转化，分时间段取样，每次离心分离的菌体 重复用到酶转化反应中。
[0061] (3)采用5, 5' -二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB)法测定L-肉碱的产量。该DTNB 法测定中，底物对产物测定的结果不会造成影响，使用L-肉碱特异性识别的肉碱乙酰转移 酶（CAT)然后结合DTNB显色，测定其412nm处的吸收值。取4h时候离心的上清液，L-肉 碱产量为6. 5g/L，摩尔转化率约为36 %。
[0062] 实施例3 :
[0063] 1.产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌的构建
[0064] 同上实施例2步骤1。
[0065] 2.大肠杆菌基因工程菌 BL21 (DE3) ApET28a-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)全细胞 酶源的制备
[0066] (1)配制产酶培养基：甘油10ml/L、蛋白胨5g/L、酵母粉15g/L、KH2P0 45g/L、 K2HP045g/L、富马酸钠4g/L以及巴豆甜菜碱4g/L，pH为6。灭菌。
[0067] (2)接种量1% (V/V)，将大肠杆菌基因工程菌逐级活化培养后，接于装有产酶培 养基的容器中，37°C条件下加 ImM IPTG有氧培养6小时。
[0068] (3)离心，10°C，8000rpm，收集菌体。用pH为7. 4的浓度为67mmol/l的磷酸缓冲 液洗涤细胞两次。
[0069] 3.全细胞酶转化巴豆甜菜碱制备L-肉碱
[0070] (1)将上述湿菌体（干重量为16g/L)悬浮于pH为7. 0的50mmol/l磷酸缓冲液 中，加入巴豆甜菜碱底物的浓度为50g/L。
[0071] (2)反应液置于37°C，220rpm进行酶转化，分时间段取样，每次离心分离的菌体重 复用到酶转化反应中。
[0072] (3)采用5, 5' -二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB)法测定L-肉碱的产量。该DTNB 法测定中，底物对产物测定的结果不会造成影响，使用L-肉碱特异性识别的肉碱乙酰转移 酶（CAT)然后结合DTNB显色，测定其412nm处的吸收值。取4h时候离心的上清液，L-肉 碱产量为15. 99g/L，摩尔转化率约为35%。
[0073] 实施例4 :
[0074] 1.产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌的构建
[0075] 同上实施例1步骤1。
[0076] 2.大肠杆菌基因工程菌 BL21 (DE3) ApET28a-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)全细胞 酶源的制备
[0077] (1)配制产酶培养基：甘油10ml/L、蛋白胨5g/L、酵母粉15g/L、KH2P0 45g/L、 K2HP045g/L、富马酸钠4g/L以及巴豆甜菜碱4g/L，pH为6。灭菌。
[0078] (2)接种量1% (V/V)，将大肠杆菌基因工程菌逐级活化培养后，接于装有产酶培 养基的容器中，37°C条件下加 ImM IPTG有氧培养6小时。
[0079] ⑶离心，10°C，8000rpm，收集菌体。用pH为7. 4的浓度为67mmol/l的磷酸缓冲 液洗涤细胞两次。
[0080] 3.全细胞酶转化巴豆甜菜碱制备L-肉碱
[0081] (1)加大菌体量，将上述湿菌体（干重量为35g/L)悬浮于pH为7. 0的50mmol/l 磷酸缓冲液中，加入巴豆甜菜碱底物的浓度为20g/L。
[0082] (2)反应液置于37°C，220rpm进行酶转化，分时间段取样，每次离心分离的菌体重 复用到酶转化反应中。
[0083] (3)采用5, 5' -二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB)法测定L-肉碱的产量。该DTNB 法测定中，底物对产物测定的结果不会造成影响，使用L-肉碱特异性识别的肉碱乙酰转移 酶（CAT)然后结合DTNB显色，测定其412nm处的吸收值。取4h时候离心的上清液，L-肉 碱产量为7. 5g/L，摩尔转化率约为42%。
[0084] 实施例5 :
[0085] 1.产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌的构建
[0086] 同上实施例2步骤1。
[0087] 2.大肠杆菌基因工程菌 BL21 (DE3) ApET28a-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)全细胞 酶源的制备
[0088] (1)配制产酶培养基：甘油10ml/L、蛋白胨5g/L、酵母粉15g/L、KH2P0 45g/L、 K2HP045g/L、富马酸钠4g/L以及巴豆甜菜碱4g/L，pH为6。灭菌。
[0089] (2)接种量1% (V/V)，将大肠杆菌基因工程菌逐级活化培养后，接于装有产酶培 养基的容器中，37°C条件下加 ImM IPTG有氧培养6小时。
[0090] (3)离心，10°C，8000rpm，收集菌体。用pH为7. 4的浓度为67mmol/l的磷酸缓冲 液洗涤细胞两次。
[0091] 3.全细胞酶转化巴豆甜菜碱制备L-肉碱
[0092] (1)将上述湿菌体（干重量为16g/L)悬浮于pH为7. 0的50mmol/L磷酸缓冲液 中，加入底物巴豆甜菜碱达到终浓度l〇〇g/L。
[0093] (2)反应液置于37°C，220rpm进行酶转化，没隔1小时取样离心，离心后的上清采 用5, 5' -二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB)法测定L-肉碱的产量。而离心分离的菌体重 复用到酶转化反应中。
[0094] (3)L-肉碱在酶催化4小时后上清样品中，含量达到最高值。L-肉碱产量为 30. 75g/