L，摩尔转化率约为34%。
[0095] 以上实施结果表明，经基因工程改造后的大肠杆菌具有较高的酶转化巴豆甜菜碱 生成L-肉碱的能力，酶转化反应简单快速，底物获取容易价格低廉。在上述实施例中，转化 温度37°C，pH为中性条件下，摩尔转化率最高达42%以上。本研宄中的L-肉碱产量和摩 尔转化率达到国内报道的先进水平，具有潜在的工业化应用的价值。
【主权项】
1. 一种产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌将大肠杆菌 野生株BW25113基因组上编码异柠檬酸脱氢酶磷酸酶/激酶的aceK基因删除得到大肠杆 菌突变株BWAaceK，选择厌氧诱导的质粒pET-A，在多克隆位点的Ndel/Kpnl酶切位点插 入caiBCD片段，得到第一个过表达质粒pEH-caiBCD;将caiT插入到pACYCD的Ndel/Xhol 位点，同时将caiF插入到同一pACY⑶的HindIII/EcoRI位点，得到第二个过表达质粒 pACYCD-caiT-caiF;将两个过表达质粒pEH-caiBCD和pACYCD-caiT-caiF同时转入大肠杆 菌突变株BWAaceK中，获得产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌BWAaceKApEH-caiBCD+pAC YCD-caiT-caiF)〇2. -种产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌选择IPTG诱 导的质粒pET28a，在pET28a的插入位点Ndel/Xhol插入caiBCD片段，得到第一个过表达 质粒pET28a-caiBCD;将caiF插入到pACYCD的Ndel/Xhol位点，同时将caiT插入到同一 pACYCD的HindIII/EcoRI位点，得到第二个过表达质粒pACYCD-caiT-caiF;将两个过表 达质粒pET28a-caiBCD和pACYCD-caiT-caiF同时转入大肠杆菌大肠杆菌BL21 (DE3)菌株 中，获得产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌BL21 (DE3)ApET28a-caiBCD+pACYCD-caiT-ca iF) 〇3. 根据权利要求1或2所述的产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于：从大肠 杆菌野生株BW25113的基因组上扩增caiB⑶片段，正向引物序列为：5'-GGGCATATGGATCAT CTACCCATGCC-3' ；反向引物序列为：5' -ATTGGTACCCAACCGTGAGCTATTACGCC-3'。4. 根据权利要求1或3所述的产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在 于按以下操作步骤进行： 步骤一：以大肠杆菌野生株BW25113为出发菌株，将基因组上的aceK基因删除， 得到大肠杆菌突变株BWAaceK;步骤二：从大肠杆菌野生株BW25113的基因组上扩增 caiBCD片段，引物设计正向为：5' -GGGCATATGGATCATCTACCCATGCC-3' ；引物设计反向 为：5 ' -AITGGTACCCAACCGTGAGCTATTACGCC-3 ' ；从大肠杆菌W3110的基因组上扩出基因 caiF和caiT，扩增caiF的正向和反向引物序列分别为：5'-CACGCCCATATGTGTGAAGGATA TGITGAAAAAC-3' 和 5' -CAGCTCGAGTTAACGACGCATACTCITTGACAA-3' ；扩增caiT的正向和 反向引物序列分别为：5' -GGGGAAITCATGAAGAATGAAAAGAGAAAAACGG-3' 和 5'-GCCAAGCTT TTAATCTTTCCAGTTCTGTTTCGCG-3' ；步骤三：选择一个厌氧启动子诱导的质粒pET-A为载体， 在多克隆位点的Ndel/Kpnl酶切位点插入caiBCD片段，得到过表达质粒pEH-caiBCD;将 caiF和caiT分别插入到同一个质粒pACYCD的Ndel/Xhol和EcoRI/HindllI位点，得到过表 达质粒pACYCD-caiT-caiF;步骤四：将两个过表达质粒pEH-caiBCD和pACYCD-caiT-caiF 同时转入大肠杆菌突变株BWAaceK中，获得产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌BWAaceK/ (pEH-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)。5. 根据权利要求2所述的产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于按 以下操作步骤进行： 步骤一：从大肠杆菌野生株BW25113的基因组上扩增caiB⑶片段，引物设计正向 AGCAACCGTGAGCTATTACGCC-3'（SEQIDNO. 9);步骤二：选择一个IPTG诱导启动子的质粒pET28a为载体，在多克隆位点的Ndel/Xhol酶切位点插入caiB⑶片段，得到过表达质粒 pET28a-caiBCD;步骤三：将过表达质粒pET-caiBCD转入大肠杆菌表达株BL21 (DE3)中，获 得基因工程菌此21(0￡3)/?￡128&-〇&180);步骤四 ：从大肠杆菌13110上扩出基因〇&1?和 caiT，caiF的正向和反向引物分别为：5'-CACGCCCATATGTGTGAAGGATATGITGAAAAAC-3'（SE QNO. 3)和 5' -CAGCTCGAGTTAACGACGCATACTCITTGACAA-3'（SEQNO. 4);caiT的正向和反向 引物分别为：5'-GGGGAAITCATGAAGAATGAAAAGAGAAAAACGG-3'（SEQNO. 5)和 5'-GCCAAGCTT TTAATCTTTCCAGITCTGTITCGCG-3'（SEQNO. 6);步骤五：将caiF和caiT同时插入到pACYCD 的Ndel/Xhol和EcoRI/HindIII位点，得到过表达质粒pACYCD-caiT-caiF;步骤六：将过 表达质粒pACYCD-caiT-caiF转入大肠杆菌基因工程菌BL21 (DE3) /pET28a-caiBCD中，获得 产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌BL21 (DE3V(pET28a-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)。6. 根据权利要求1 一 3之一所述的产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌的用途，其特征在 于利用所述工程菌生产L-肉碱，按以下步骤进行： 步骤一：全细胞酶源制备： 将基因工程菌常规放大培养后，接入产酶培养基；工程菌BWAaceK/pEH-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)先进行有氧培养，然后转入厌氧培养或工程菌 BL21 (DE3)ApET28a-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)进行有氧培养；在 0 ~10 °C，8000 ~ 12000rpm离心，收集菌体，用pH为6~8的10~lOOmmol/1的磷酸缓冲液洗绦两次，低温 保存菌体； 步骤二：酶转化生产L-肉碱： 在含有巴豆甜菜碱底物的转化反应液中，添加步骤一得到的湿菌体作为酶源，菌体浓 度为10~50g/L;反应液置于摇床150~220rpm进行酶转化，得到L-肉碱溶液。7. 根据权利要求6所述的产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌的用途，其特征在于：步骤 一中，产酶培养基的组成为：甘油1~l〇ml/L、蛋白胨5~20g/L、酵母粉5~20g/L、KH2P04 1~10g/L、K2HP04 1~10g/L、富马酸钠0~10g/L以及巴豆甜菜碱0~10g/L，pH为6~ 8〇8. 根据权利要求6所述的产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌的用途，其特征在于：步骤 一中，工程菌BW A aceKApEH-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)先进行有氧培养，然后转入厌氧 培养，厌氧培养的条件为：振荡培养或发酵罐培养，有氧培养〇~6小时，厌氧诱导培养5~ 24h ;工程菌 BL21(DE3V(pET28a-caiBCD+pACYCD-caiT-caiF)进行有氧培养件为：振荡培 养或发酵罐培养，有氧培养〇~6小时。9. 根据权利要求6所述的产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌的用途，其特征在于：步骤 二中，转化反应液的pH为7. 0,底物巴豆甜菜碱的浓度为20~100g/L，转化反应进行的条 件为：30~39°C，瓶装量1/10~1/3,反应时间1~4小时。10. 根据权利要求6所述的产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌的用途，其特征在于：步 骤二中所述巴豆甜菜碱利用拆分废物D-肉碱进行脱水制备而得。
【专利摘要】本发明涉及一种产L-肉碱的大肠杆菌基因工程菌的构建方法和用途。所述基因工程菌是通过将编码巴豆甜菜碱转化为L-肉碱的三个关键基因caiB、caiC和caiD连同转运子编码基因caiT和正调控子caiF一起转入大肠杆菌中过表达，通过厌氧启动子控制或IPTG诱导L-肉碱合成相关基因的表达，同时删除大肠杆菌自身的编码异柠檬酸脱氢酶磷酸酶/激酶的aceK基因。基因工程菌经产酶培养后，收集菌体作为全细胞酶源，直接转化巴豆甜菜碱生成L-肉碱，经转化后，L-肉碱产量最高可达30g/L以上，摩尔转化率最高为42％，产量和转化率比野生株提高了60倍以上，达到国内报道的生物法制备的领先水平。本发明的基因工程菌对底物的转化效率高，酶反应工艺简单，生产原料成本低廉，节约资源，无污染。CCTCC NO:M201526220150428CCTCC NO:M201526320150428
【IPC分类】C12R1/19, C12N15/70, C12N1/21, C12P13/00
【公开号】CN104928225
【申请号】CN201510278530
【发明人】黄娇芳, 孙立洁, 陈祥松, 袁丽霞, 王纪, 吴金勇, 朱薇薇, 王刚, 姚建铭, 史吉平, 魏东
【申请人】武汉中科光谷绿色生物技术有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年5月27日