。
[0043](2)构建随机单链寡核苷酸文库并得到纯化的单链DNA文库:
[0044]构建随机单链寡核苷酸文库:设计合成78碱基对的随机单链DNA文库:5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中 N 代表碱基 AGCT 中的任意一个，容量为114-1O15;构建上游引物:5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3’，构建下游引物5’ 一TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’。并进一步得到纯化的单链ssDNA文库用于H37Rv适配子的SELEX技术筛选。
[0045]设计并得到纯化的单链DNA文库可以通过一般的PCR(聚合酶链式反应)扩增、不对称PCR法和酚氯仿法纯化得到。
[0046]步骤2
[0047]利用SELEX技术筛选结核分枝杆菌标准株H37Rv适配子:
[0048]用包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值9.6)将H37Rv包被于微孔板中，同时设空白反筛孔，非结核分枝杆菌和非分枝杆菌反筛孔；H37Rv包被孔和反筛孔均以3%BSA(牛血清白蛋白)封闭；ssDNA文库和SELEX结合缓冲液混匀后先与反筛孔于37°C下进行孵育，去除与BSA和微孔板结合的ssDNA ;然后转移到H37Rv包被孔于37°C下进行孵育，SELEX冲洗缓冲液洗涤，甩干后加入SELEX洗脱缓冲液于80°C作用lOmin，洗脱与H37Rv结合的ssDNA，产物经酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化，PCR扩增后，进行下一轮筛选。共进行10轮筛选。第1-4轮进行空白孔反筛，第5-7轮以非分枝杆菌为背景进行反筛，第8-10轮进行以非结核分枝杆菌为背景的反筛。
[0049]筛选后的饱和文库，经克隆测序，获得单个适配子。该适配子即为能与H37Rv结合的DNA适配子，其序列为:
[0050]5 ’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATATCCCTATTCCGCTCCATGTTGCGTACCCGTGCCTTCGACATGAGGCCCGGATC-3，
[0051]并进行结构分析获得该适配子的二级结构图谱(图1)。
[0052]本发明的实施例所用的SELEX结合缓冲液为:20mmol/L Hepes, pH值7.35，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，lmmol/LCaCl2，lmmol/L MgCl2;SELEX 冲洗缓冲液为:SELEX结合缓冲液+0.05% Tween 20 ;SELEX洗脱缓冲液为:20mmol/L Tris-HCl，4mol/L异硫氰酸胍，lmmol/L DTT，pH 值 8.3。
[0053]步骤3:
[0054]应用本发明H37Rv适配子构建检测体系，并检测临床菌株。
[0055]选择具有高亲和性的H37Rv适配子或适配子组合构建基于适配子的三明治夹心ELISA检测体系，用于102株临床菌株的检测(MTB共64株，NTM为28株和非分枝杆菌为10株)。
[0056]酶标板经30W 75cm的紫外灯照射处理12h。适配子用分光光度计测浓度，并经94°C变性5min，冰浴1min进行预处理；处理后的适配子用包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，PH值9.6)稀释，按照每孔I Ug的浓度作为捕获适配子包被酶联板，4°C过夜；然后3%85六(牛血清白蛋白)37°〇下封闭Ih;
[0057]将菌体样品用PBS稀释至10 μ g/mL，以100 μ L/孔加入封闭后的酶标板，37°C孵育Ih，加入PBST洗涤3次，3min/次；
[0058]将5'端生物素标记的另一个适配子作为检测适配子，SELEX结合缓冲液稀释至0.5 μ g/孔加入酶标板，370C，40min, SELEX洗涤缓冲液洗涤5次，3min/次；
[0059]加入1:1000的链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶100 μ 1，37°C孵育30min ;加入PBST洗涤5次，3min/次；
[0060]显色试剂A与显色试剂B按照1:1的比例混合加入，370C孵育lOmin，加入终止液终止显色；加入PBST洗涤3次，3min/次；
[0061]利用酶标仪双波长(450nm和620nm)检测样本的吸光度值(A450，A620)。
[0062]结果判断:进行结果判断的OD值应为0D450nm与0D620nm的差值。阳性对照组(包括一株标准株H37Rv和63株MTB菌株)OD值平均0.66 ；阴性对照组平均OD值=0.35 (包括28株NTM和10株非分枝杆菌，OD均值分别为0.38和0.29)。其中结核分枝杆菌组和非结核分枝杆菌组之间的OD值差异有统计学意义(P〈0.01 ；AUC = 0.9810,95% Cl:
0.9598-1.002);结核分枝杆菌组和非分枝杆菌组之间的OD值差异有统计学意义(P〈0.01 ；AUC = 0.9810,95% Cl:1.000-1.000)。
[0063]结果解释:应用本发明中H37Rv的ssDNA适配子组合构建的检测体系可以特异性地检测出结核分枝杆菌菌株，非结核分枝杆菌和非分枝杆菌。
[0064]本发明的H37Rv适配子用于细菌学检测能特异性地检出结核分枝杆菌菌株。
[0065]步骤4:
[0066]FITC标记H37Rv适配子，荧光显微镜下观察临床菌株的结果。
[0067]待测菌株:结核分枝杆菌标准株H37Rv, 3种NTM(堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌、鸟分枝杆菌)和3种非分枝杆菌(大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌)。
[0068]将本发明中的H37Rv适配子用FITC荧光标记，并经94°C变性5min，冰浴15min进行预处理；用500 μ L的PBS混匀处理后的适配子和不同菌体(2 X 17CFU), 37°C温和震荡作用40min，12000rpm离心5min，用ddH20洗涤沉淀四次，沉淀重悬于ddH20中，分别取10 μ L沉淀涂片在荧光显微镜观察。
[0069]结果观察:结核分枝杆菌标准株H37Rv在荧光显微镜下均可见较强的绿色荧光(图2)，非结核分枝杆菌和非分枝杆菌在显微镜下均未观测到绿色焚光(图3和图4)。
[0070]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1.一种结核分枝杆菌标准株H 37Rv的DNA适配子，其特征在于:所述DNA适配子的核苷酸序列为:5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATATCCCTATTCCGCTCCATGTTGCGTACCCGTGCCTTCGACATGAGGCCCGGATC-3，。2.如权利要求1所述的DNA适配子在细菌学检测中的应用。3.根据权利要求2所述的DNA适配子在细菌学检测中的应用，其特征在于，在检测结核分枝杆菌中的应用。4.一种结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，包含有如权利要求1所述的DNA适配子。5.一种制备如权利要求1所述的DNA适配子的方法，其特征在于包括以下步骤: 步骤I，构建随机单链寡核苷酸文库:设计合成78碱基的随机单链DNA文库:5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中 N 代表碱基 AGCT 中的任意一个，文库容量为1014-1015，并进一步纯化单链ssDNA文库用于结核分枝杆菌标准株H37Rv适配子的SELEX技术筛选； 步骤2，利用SELEX技术筛选H37Rv适配子:用包被缓冲液将结核分枝杆菌标准株H37Rv包被于微孔板中，同时设空白反筛孔，非结核分枝杆菌和非分枝杆菌反筛孔；ssDNA文库和SELEX结合缓冲液混匀后先与空白反筛孔进行孵育；然后转移到H37Rv包被孔进行孵育，SELEX冲洗缓冲液洗涤，甩干后加入SELEX洗脱缓冲液洗脱与H37Rv结合的ssDNA，产物经酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化，PCR扩增后，进行10轮筛选，筛选后的饱和文库，经克隆测序，获得单个适配子。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:步骤2中使用的SELEX结合缓冲液成分为:20mmol/L Hepes,120mmol/L NaCl,5mmol/L KCl,lmmol/L CaCl2,lmmol/L MgCl2;SELEX结合缓冲液pH为7.35。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:步骤2中使用SELEX冲洗缓冲液成分为:20mmol/L Hepes,120mmol/L NaCl,5mmol/L KCl，lmmol/L CaCl2,lmmol/L MgCl2,0.05 %Tween 20。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:步骤2中使用SELEX洗脱缓冲液成分为:20mmol/L Tris-HCl，4mol/L 异硫氰酸胍，lmmol/L DTT ；SELEX 洗脱缓冲液 pH 为 8.3。9.一种三明治夹心ELISA检测方法，其特征在于:利用如权利要求1所述的结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA适配子进行检测。
【专利摘要】本发明提供了一种结核分枝杆菌标准株H37Rv的DNA适配子及其制备方法，本发明的结核分枝杆菌标准株H37Rv的ssDNA适配子亲和性、特异性高，其用于细菌学检测能高特异性地检测出结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和非分枝杆菌，可以为结核病的实验室诊断提供有利依据。
【IPC分类】C12N15/115, C12N15/10, G01N33/569
【公开号】CN104946655
【申请号】CN201510379009
【发明人】秦莲花, 胡忠义, 杨华, 如斯坦木江·艾麦提
【申请人】上海市肺科医院
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月1日