的。另外，不同的突变插入盒能够保 证突变的多样性。这样，使用TDEM突变技术就可以得到一个饱和的、分辨率高的、多样的整 合酶突变库。
【附图说明】
[0057] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0058] 图1为本发明涉及质粒的结构示意图；
[0059] a为质粒pCompact-kana不意图，为质粒pCompact-kana-IN提供载体；
[0060] b 为质粒 pCompact-kana-IN 不意图；
[0061] c 为质粒 pMutationlnsert 不意图；
[0062] d 为质粒 pFrameCheck 不意图。
[0063] 图2为突变插入盒（mutation insert, MI)结构的示意图；
[0064] NNN代表编码20个氨基酸的密码子，分别是GCC，丙氨酸；CGC，精氨酸；AAC，天冬 酰胺；GAT，天冬氨酸；TGC，半胱氨酸；CAG，谷氨酰胺；GAA，谷氨酸；GGC，甘氨酸；CAT，组氨 酸；ATC，异亮氨酸；CTG，亮氨酸；AAA，赖氨酸；ATG，甲硫氨酸；TTT，苯丙氨酸；CCA，脯氨酸； AGC，丝氨酸；ACC，苏氨酸；TGG，色氨酸；TAC，酪氨酸；GTG，缬氨酸。通过BpmI和BsgI酶切、 平末端化、片段自连一系列过程，在一个转座事件中就可以得到20个突变，大大增加了突 变库的多样性。
[0065] 图3为TDEM流程图。
[0066] 表1是构建质粒时扩增片段所用的引物序列及模板。
[0067] I. BsaI识别位点，2. BsgI识别位点，3. NotI识别位点，4. BpmI识别位点，*NNN代 表除去GCC。
【具体实施方式】
[0068] 表1、构建质粒时扩增片段所用的引物序列及模板
[0069]
[0070]
[0071] ι·质粒的构建
[0072] I. I pCompact-Kana-IN
[0073] I. I. I pCompact-Kana
[0074] 质粒复制起点（Origin)和卡那霉素抗性基因 （Kanamycin R)由表1和图1所示 引物和模板通过聚合酶链式反应（PCR)扩增而来，得到的PCR产物是平末端的片段，这两个 片段由T4DNA连接酶催化连接得到质粒pCompact-Kana。
[0075] (1)扩增片段 Origin
[0076] PCR 反应体系：模板 pUC19 (Takara, 2ng/ μ 1)，引物 0ri-up/0ri-lo (0· 5 μ Μ)， l*Pfu DNA 聚合酶 Buffer，d ΝΤΡ(0· 2mM each)，Pfu DNA 聚合酶（Promega，0. 05U/ μ 1)，双 蒸水加至总体积50 μ 1。
[0077] (2)扩增片段 Kanamycin R :
[0078] PCR 反应体系：模板 pCR Blunt II-TOPO(Invitrogen，2ng/ μ 1)，引物 Kan-up/ Kan-lo (0· 5 μ Μ)，l*Pfu DNA 聚合酶 Buffer，d NTP (0· 2mM each)，Promega Pfu DNA 聚合酶 (Promega，0· 05U/ μ I)，双蒸水加至总体积50 μ I。
[0079] 两个片段PCR扩增程序相同：
[0080]
[0081] (3)连接反应体系及条件：Kanamycin R 片段（3pmol)，Origin 片段（Ipmol)， 1*T4DNA连接酶Buffer，T4DNA连接酶（Takara, 1 μ 1)，双蒸水加至20 μ 1，16°C连接过夜 (约12小时，下同）。
[0082] I. I. 2 pCompact-Kana-IN
[0083] HIV-I整合酶基因（IN)由引物IN-up和IN-Io (包含BsaI酶切位点 GTGCAG (N) 16丨/丨H(N)CTGCAC)以HIV-I克隆质粒pNL4. 3 (由美国国立卫生院（NIH)艾 滋病研宄和参考试剂项目提供）为模板扩增IN片段（图1和表1)，pCompact-Kana-IN质 粒载体部分是用引物Ori-Io和Kan-up，以I. I. 1所得质粒pCompact-Kana为模板扩增而 来，然后将两个片段由T4DNA连接酶催化连接得质粒pCompact-Kana-IN。
[0084] (1)扩增整合酶基因（IN)
[0085] PCR 反应体系：模板 pNL4-3 (2ng/ μ 1)，引物 IN-up/IN-lo (0· 5 μ M)，l*Pfu DNA 聚 合酶1?1^€61'，(11'01:>(0.2111163(311)，？;1!\1〇嫩聚合酶（?1'〇111683,0.0511/以1)，双蒸水加至总体 积 50 μ 1。
[0086] 扩增程序：95°C 2min，1个循环
[0087]
[0088] ⑵扩增载体片段
[0089] PCR 反应体系：模板 pCompact-Kana (2ng/ μ 1)，引物 IN-up/IN-lo (0· 5 μ M)，l*Pfu DNA 聚合酶 Buffer，d ΝΤΡ(0· 2mM each)，Pfu DNA 聚合酶（Promega，0. 05U/ μ I)，双蒸水加 至总体积50 μ 1。
[0090] 扩增程序：95°C 2min，1个循环
[0091]
[0092] (3)将两个片段按以下体系和条件连接：整合酶片段（3pmol)，载体片段（Ipmol)， 1*T4DNA连接酶Buffer，T4DNA连接酶（Takara，1 μ 1)，双蒸水加至20 μ 1，16°C连接过夜。
[0093] I. 2 pMutationinsert
[0094] 步骤1、PCR反应扩增质粒复制起点（Origin)和博来霉素抗性基因（zeocin)，扩 增Origin片段的PCR反应体系及程序与I. I. I (1)方法一致。扩增zeocinR片段的PCR反 应体系是：模板 pZero-1 (Invitrogen, 2ng/ μ 1)，引物 Zeo-up/Zeo-lo (0· 5 μ M)，l*Pfu DNA 聚合酶1?1^€61'，(11'01:>(0.2111163(311)，？;1!\1〇嫩聚合酶（？1'〇111683,0.0511/4 1)，双蒸水加至总 体积50 μ 1，扩增程序：
[0095]
[0096] 将这两个片段按以下体系由T4DNA连接酶催化连接：Zeocin片段（3pmol)，0rigin 片段（Ipmol)，1*T4DNA 连接酶 Buffer，T4DNA 连接酶（Takara，1 μ I)，双蒸水加至 20 μ 1， 16 °C连接过夜。
[0097] 步骤2、PCR扩增质粒stuffer部分（图lc)，PCR反应体系是模板 pET29a(Invitrogen，2ng/yl)，引物 Stfl-up/Stfl-lo(0.5yM)，l*Pfu DNA 聚合酶 Buffer，d NTP (0.2mM each)，Pfu DNA 聚合酶（Promega，0.05U/μ 1)，双蒸水加至总体积 50 μ 1，扩增程序：
[0098]
[0099] 步骤3、以上述步骤1连接产物为模板，反应体系是：模板Ong/yl)，引物 0ri-up/Ze〇-up(0· 5 μΜ)，l*Pfu DNA 聚合酶 Buffer，d NTP(0. 2mM each)，Pfu DNA 聚合酶 (Promega，0· 05U/ μ I)，双蒸水加至总体积50 μ I，扩增程序：
[0100]
[0101] 步骤4、通过步骤3的PCR得到图Ic所示Origin和Zeocin两个片段的连接片段， 然后与stuffer片段（步骤2所得）以以下体系和方法连接：步骤3的扩增片段（3pmol)， stuffer 片段（Ipmol)，1*T4DNA 连接酶 Buffer，T4DNA 连接酶（Takara, 1 μ 1)，双蒸水加至 20 μ 1，16°C连接过夜。连接产物即为质粒pMutationlnsert。
[0102] 图Ic所示NNN部分是设计的将要取代原来目的基因三个碱基的部分（原理可见 图3步骤c)。为了保证突变的多样性，NNN三个碱基代表了编码20个氨基酸的密码子， 具体为：分别是GCC，丙氨酸；CGC，精氨酸；AAC，天冬酰胺；GAT，天冬氨酸；TGC，半胱氨酸； CAG，谷氨酰胺；GAA，谷氨酸；GGC，甘氨酸；CAT，组氨酸;ATC，异亮氨酸；CTG，亮氨酸;AAA， 赖氨酸；ATG，甲硫氨酸；TTT，苯丙氨酸；CCA，脯氨酸；AGC，丝氨酸；ACC，苏氨酸；TGG，色氨 酸；TAC，酪氨酸；GTG，缬氨酸。
[0103] 构建第一种pMutationinsert时，NNN是位于引物Ze〇-up 5'端的第一个GCC，即 编码丙氨酸的密码子。这个质粒构建完成之后，以其为模板，用引物MI-UP/MI-L0(表1，由 于NNN代表了 19个密码子，一共有19对MI-UP/MI-L0)来定点突变NNN碱基位置的GCC为 其他19个密码子，一共得到20种pMutationinsert质粒。
[0104] 定点突变 PCR 体系：模板（2ng/yl)，引物 MI-UP/MI-L0(0.5yM)，l*Pfu DNA 聚合 酶1?1^€61'，(11'01:>(0.2111163(311)，？;1!\1〇嫩聚合酶（?1'〇111683,0.0511/以1)，双蒸水