Hiv-1整合酶突变体库的构建法
【技术领域】
[0001] 本发明属于艾滋病治疗药物的开发设计领域，构建的整合酶突变体库可以用来筛 选对Hiv-I整合酶有抑制作用的药物。
【背景技术】
[0002] 高效抗病毒疗法（HAART)是目前FDA批准的治疗AIDS的标准方案，但至今始终没 有治愈的案例。同时，因疫苗大都可能只有预防而无治疗功能；即使使用疫苗，大部分当今 的HIV-I感染者最终还是会发展成为艾滋病患者。因此，开发新的化学药物来阻止病情的 发展意义重大。
[0003] 整合酶（IN)是HIV-I复制必需的三个基本酶之一，在其生活史中扮演了重要角 色。目前，雷特格韦和埃替格韦是仅有的两种经过FDA通过的针对IN的药物。而其它现有 的30多种获批HIV抑制剂主要都是针对逆转录酶和蛋白酶设计的。由于作用靶点不同，IN 抑制剂不受目前大多数的因化疗所产生的耐药性影响。且IN的序列只存在于病毒中，哺乳 动物均无对应酶，所筛选到的抑制剂在治疗中将会更加安全、有效。因此，IN成为十分有前 景的抗HIV药物设计的新靶标。
[0004] 临床观察显示，对新药的耐药性引起的病情变化进行分析至关重要。这需要多年 的临床研宄和细致的统计分析。研宄发现，一些IN突变体对于正在进行临床实验或已经上 市的IN抑制剂具有耐受性。这些信息的获得对于目前IN抑制剂的结构修饰以及未来合理 有效的开发新IN抑制剂有着重要意义。但这样的筛选过程耗时耗力，且覆盖的范围十分有 限，所花费的总经费也不少。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种运用TDEM(转座子导向的碱基替换突变方 法）来开发一个饱和的具有高分辨率的突变库，以解决常规突变方法效率及覆盖率低或者 特异性好但分布不均等不足。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种HIV-I整合酶突变体库的构建法，包括 如下内容：
[0007] (1)、利用转座子的转座，以及转座子两端限制性内切酶在目的基因随机位点制造 空隙，插入突变插入盒（预先设计的），再利用盒上的限制性内切酶位点，通过酶切自连，实 现目的基因上3个碱基的替换，目的基因翻译成蛋白后，造成目的蛋白上一个或连续两个 氨基酸的突变；
[0008] (2)、利用定点突变PCR，使突变插入盒上的用于替换原目的基因3个碱基的3个碱 基，由编码半胱氨酸的密码子突变为编码其他19个氨基酸的密码子，从而来增加最终突变 库的多样性。
[0009] 备注说明：其他19个氨基酸的密码子，具体如下：
[0010] GCC，丙氨酸；CGC，精氨酸；AAC，天冬酰胺；GAT，天冬氨酸；CAG，谷氨酰胺；GAA，谷 氨酸；GGC，甘氨酸；CAT，组氨酸；ATC，异亮氨酸；CTG，亮氨酸；AAA，赖氨酸；ATG，甲硫氨酸； TTT，苯丙氨酸；CCA，脯氨酸；AGC，丝氨酸；ACC，苏氨酸；TGG，色氨酸；TAC，酪氨酸；GTG，缬 氨酸。
[0011] 作为本发明的HIV-I整合酶突变体库的构建法的改进，包括如下步骤：
[0012] -、质粒的构建：
[0013] 1)、质粒pCompact-Kana-IN的构建，包括以下步骤：
[0014] ① 、质粒 pCompact-Kana 的构建：
[0015] 片段Origin和片段Kanamycin R，由T4DNA连接酶催化连接得到质粒 pCompact-Kana ；
[0016] ②、质粒 pCompact-Kana-IN 的构建：
[0017] 以pCompact-Kana为模板，扩增获得载体片段；
[0018] 整合酶片断和载体片段由T4DNA连接酶催化连接，得质粒pCompact-Kana-IN ;
[0019] 2)、质粒pMutationinsert的构建，包括以下步骤：
[0020] ①、Zeocin片段和Origin片段，由T4DNA连接酶催化连接；
[0021] ②、PCR扩增质粒stuffer部分；
[0022] ③、以上述步骤①的连接产物为模板进行PCR，得到Origin和Zeocin两个片段的 连接片段；
[0023] ④、以步骤③扩增所得的片段、步骤②所得的stuffer片段，由T4DNA连接酶催化 连接，得到质粒pMutationinsert ;
[0024] 3)、质粒pFrameCheck的构建，包括以下步骤：
[0025] ①、片段载体部分（pCompact-Kana)，E. coli乳糖启动子（Plac)，丝状菌体fd 次要衣壳蛋白的gill信号序列（gill)，填充基因（stuffer)，以及β -内酰胺酶基因 (Amp-R)分别进行PCR反应扩增；
[0026] ②、5个片段依次连接；得质粒pFrameCheck ;
[0027] 二、转座子导向的碱基替换突变方法：
[0028] 1)、转座反应：
[0029] 为了表达Nd-MuA，包含Nd-MuA的质粒通过转化进入E. coli BL21(DE3) RIL感受态 细胞中，诱导Nd-MuA的表达；
[0030] 再利用纯化后的Nd-MuA催化Mu转座子转座进入包含目的基因 HIV-I整合酶基因 的质粒 pCompact-Kana-IN 中；
[0031] 2)、去除转座子插入质粒载体的转座；
[0032] 得到转座子插到整合酶的转座产物；
[0033] 3)、去除转座子：
[0034] 用NotI酶切步骤2)得到的转座产物，琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收大片段 (即，满足2. 7kb大小的片段），将得到整合酶随机位置断开的线性DNA ;
[0035] 4)、插入MI替代转座子：
[0036] 片段Zeocin，NNN以及stuffer片段组成了 MI片段；
[0037] 用T4DNA连接酶将所述线性DNA和MI片段连接；
[0038] 5)、BsgI 去除 MI 右臂：
[0039] BsgI酶切上述步骤4)得到的质粒，琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收大片段 (即，大小为3. Ikb的片段）；
[0040] 并使得BsgI酶切后片段5'端突出末端补平或3'端突出末端削平，然后将所得产 物用T4DNA连接酶（Takara)自连；
[0041] 6)、BpmI 去除 MI 左臂：
[0042] BpmI酶切上述步骤5)得到的质粒，得到含有突变整合酶基因的质粒；从而获得突 变分布均匀，且多样的突变库。
[0043] 备注说明：
[0044] 该质粒包含用NNN替代了整合酶基因上随机3个碱基的突变体；
[0045] 如果该步骤无法获得本发明所希望的结果时，可返回至步骤1)的转座反应，重新 进行操作，直至能获得一个突变分布均匀，且多样的突变库为止。
[0046] 作为本发明的HIV-I整合酶突变体库的构建法的进一步改进，还包括如下步骤：
[0047] 三、利用pFramecheck质粒，剔除有移码突变及终止密码子的突变。
[0048] 作为本发明的HIV-I整合酶突变体库的构建法的进一步改进：
[0049] 所述步骤三包括以下步骤：
[0050] (I)、BsaI酶切质粒pFramecCheck，割胶回收大片段（即，大小为2. 9kb的片段）， 从而得到去除IacZa基因的线性片段；
[0051] ⑵、BsaI酶切所述含有突变整合酶基因的质粒，割胶回收0. 9k的整合酶突变基 因；
[0052] (3)将步骤（1)和步骤⑵得到的片段在T4DNA连接酶的催化下连接，转化到 E. coli DH5 α菌株化学感受态细胞中，涂布在含有50 μ g/ml卡那霉素和50 μ g/ml氨苄青 霉素的LB固体培养基上；从而使所得的质粒去除了含有移码突变或终止子的突变。
[0053] 即，本发明通过构建一个饱和的、高分辨率的整合酶突变体库，来解决药物筛选过 程中遇到的问题。
[0054] 本发明的主要特点在于：（1)本发明使用MuA转座酶催化转座子插入整合酶 基因，为了筛选到耐药的少数病毒株，最理想的情况是目的片段的每一个碱基都发生突 变，商业MuA转座酶的位点偏好性不能满足这一点，有研宄发现N端缺失的MuA转座 酶（N-terminally deleted MuA transposase,以下均简称为Nd-MuA)在优化后的条件 下，能够降低转座反应的位点偏好性，并且效率提高了 20倍。本实验采用了优化条件下 的Nd-Mu催化转座反应，保证了突变库中突变分布均匀。（2)本实验采用预先设计的MI cassettes(mutation insert cassettes，突变插入盒）替代插入目的基因的转座子，可以 精确地控制突变的碱基数目，一轮TDEM可以造成随机位点3个碱基的替换，从而使整合酶 随机位点一个或连续两个氨基酸发生突变。（3)由于突变方法不可避免的会产生移码突变 或终止密码子，以往的文献报道中，这些无功能的突变约占所有突变的50%，本实验利用 pFrameCheck质粒对突变库进行frame check，去除无功能的突变，应用突变库进行药物筛 选时效率更高。
[0055] 本发明的优点和效果如下：
[0056] 本发明利用TDEM突变技术，构建HIV整合酶饱和的突变库，与其他突变方法相比， TDEM能使突变在目的基因上随机分布，而且由于Nd-Mu的催化反应的高效率以及低位点偏 好性的特点，突变能在基因上均匀分布。TDEM中突变插入盒的使用，可以使得每一轮TDEM 过后，只有3个碱基发生突变，而且突变的数目是可控