加至总体积 50 μ 1，扩增程序：
[0105]
[0106] I. 3 pFrameCheck
[0107] 构建 pFrameCheck(图 Id)时，图 Id 中的片段载体部分（pCompact-Kana)，E. coli 乳糖启动子（Plac)，丝状噬菌体fd次要衣壳蛋白的gill信号序列（gill)，填充基因 (stuffer)，以及β -内酰胺酶基因（Amp-R)分别由PCR反应扩增，扩增体系分别是：模 板（附表1所列）（2ng/ μ 1)，引物（附表1所列，0· 5 μΜ)，l*Pfu DNA聚合酶Buffer，d NTP (0· 2mM each)，Pfu DNA 聚合酶（Promega，0· 05U/ μ I)，双蒸水加至总体积 50 μ I，扩增 程序：
[0108]
[0109] 5个片段依次连接：pCompact-Kana与Amp-R以以下体系连接：pCompact-Kana (载 体，3pmol)，Amp-R 片段（插入片段，lpmol)，1*T4DNA 连接酶 Buffer，T4DNA 连接酶 (Takara, 1 μ 1)，双蒸水加至20 μ 1，16°C连接过夜，得到质粒I。质粒I为模板，Amp-up/ Ori-Io为引物，按上文PCR反应体系及程序（延长时间调整为2min)，扩增得到片段1。片 段1 (载体）与Plac片段（插入片段）按上文连接反应体系和条件连接得到质粒II，以质 粒II为模板，Plac-lo/Amp-up为引物，按上文PCR反应体系及程序（延长时间为2min)扩 增得到片段2。片段2 (载体）与gill (插入片段）按上文连接反应体系和条件连接得到 质粒III。质粒III为模板，glll-lo/Amp-up为引物，按上文PCR反应和程序（延长时间为 2. 5min)，扩增得到片段3。片段3 (载体）与StufTer片段（插入片段）按上述连接反应体 系和条件连接，得到质粒pFrameCheck。
[0110] 2. TDEM (转座子导向的碱基替换突变方法）流程：
[0111] 2. 1转座反应（图3. a):
[0112] 为了表达Nd-MuA，包含Nd-MuA的质粒（构建方法在Kim&Morrison, 2009这篇 文献中详细描述），通过转化进入E. coli BL21 (DE3)RIL感受态细胞中，37°C，225rpm振 荡培养至0D600 = 0. 6,加入IPTG至终浓度ImM，37 °C继续振荡培养4小时诱导Nd-MuA 的表达，然后利用Ni-NTA亲和层析柱纯化Nd-MuA，利用纯化后的Nd-MuA催化Mu转座子 (Ml-Cam.?，Finnzymes, Espoo, Finland)转座进入包含目的基因 HIV-I整合酶基因的质粒 pCompact-Kana-IN 中。
[0113] 上述文献具体为：Kim, Y. C.，&Morrison, S. L. (2009) · N-terminal domain-deleted mu transposase exhibits increased transposition activity with low target site preference in modified buffers. J Mol Microbiol Biotechnol, 17(I), 30-40. doi:10. 1159/000178019。
[0114] 转座反应体系为印(：〇11^^(^-1^仙-預(60伽〇1)，]\11-03111(25伽〇1)，1*转座 Buffer(25m M Tris(pH 8. 0), 5m M MgCl 2, ll〇m M NaCl, 0. 05 % Triton X-100, l〇 % glycerol，15% DMS0)，纯化的 Nd-MuA(3pmol)，双蒸水加至总体积 20 μ 1，30°C作用 2h，75°C 灭活转座酶。利用苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1)纯化转座体系DNA，纯化步骤为：1.加入 与转座体系等体积的苯酷/氯仿/异戊醇（25:24:1)溶液，混合均勾，12000g离心IminJi 其分层；小心地用枪头将上层吸出，加入新的管子；加入〇. 1体积的3M Sodium acetate (醋 酸钠，pH5. 2)，混合均匀；加入2倍体积100%无水乙醇，混合均匀；4°C，12000g离心5min， 将液体全部吸走；加入100 μ I 70 %乙醇清洗，上下吹打后，12000g离心5min，弃去液体； 自然风干3min左右，加入3μ1水溶解，即为纯化所得DNA。然后将其加入50μ1 E. coli DH5a电转感受态中，并转移至预冷的BioRad? 〇. 2cm电击杯，2. 3kV电压条件下电击后，迅 速转入950 μ I S0C，37°C 225rpm振荡，恢复培养lh，将50 μ 1转化产物在含有50 μ g/ml卡 那霉素和7 μ g/ml氯霉素的LB平板中37°C恒温培养过夜，另外的950 μ 1转化产物在含有 50 μ g/ml卡那霉素和7 μ g/ml氯霉素的LB液体培养基中37 °C 225rpm震荡培养过夜。
[0115] 次日LB平板中有约1300个克隆（50 μ 1)，原转化产物（Iml)总共应约有1300*20 个转座事件。由于目的片段整合酶基因有864个碱基，按每个碱基位置都有转座子插入这 种情况来计算，有6倍的覆盖率。因此，转座反应的效率是足够的。转座反应的效率与纯化 的酶的纯度以及电转感受态的效率有关，因此可以通过优化这两个因素来得到足够的转座 事件。由于转座反应的随机性以及低位点偏好性，转座子有可能插入到质粒的目的基因之 外的区域，因此，需要有一步去除转座子插入到载体上这一转座情况。
[0116] 2. 2去除转座子插入质粒载体的转座情况
[0117] 转座反应之后所得质粒中整合酶基因的两端是BsaI酶切位点，如果转座子正确 的插入整合酶基因，那么用BsaI酶切质粒（酶切位点为GGTCTCN丨/丨NNNNNGAGACC，I表 示酶切口，碱基序列从5'到3'端），将会在琼脂糖凝胶上得到两个条带：整合酶+转座子 (0.9k+l. 3k)以及质粒载体（1.8k)。如果转座子插入载体基因，那么用BsaI酶切质粒，将 会在琼脂糖凝胶上得到两个条带：整合酶（〇. 9k)以及载体+转座子（I. 8k+l. 3k)。由于转 座酶催化的反应的到的是上述两种情况的混合质粒，那么用BsaI酶切上述步骤2. 1所得质 粒将会得到4条（0. 9k，I. 8k，2. 2k，3. Ik)带。我们回收整合酶+转座子（2. 2k)以及载体 (1.8k)两条带，用T4DNA连接酶进行连接，然后转化到E. coli DH5a化学感受态细胞中，在 含有50 μ g/ml卡那霉素和7 μ g/ml氯霉素的LB液体培养基中，37 °C，225rpm振荡培养过 夜，将得到转座子插到整合酶这一种情况的转座产物。
[0118] 2. 3去除转座子（图3. b)
[0119] 转座子的两端都是NotI酶切位点，用NotI酶切（NEB，酶切位点为GCGGCC丨GC) 步骤（2)得到的转座产物，琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收大片段（即，满足2. 7kb大 小的片段），将得到整合酶随机位置断开的线性DNA。
[0120] 2. 4插入MI替代转座子（图3. b)
[0121] 在构建pMutationlnsert的质粒部分中，我们提到一共有20种不同的 pMutationlnsert质粒，如附图Ic所示，片段Zeocin，NNN以及stuffer片段组成了附图2中 的MI片段。MI片段的两端是NotI酶切位点，用NotI酶切20个pMI等质量的混合质粒，琼 脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收大片段（即大小为I. 3kb的片段），用T4DNA连接酶就可 以将上述步骤2. 3得到的线性DNA和MI片段连接（图3流程图中b)，连接体系及条件是：步 骤2. 3所得的线性片段（载体，3pmol)，MI片段（插入片段，lpmol)，1*T4DNA连接酶Buffer， T4DNA连接酶（Takara，1 μ 1)，双蒸水加至20 μ 1，16°C连接过夜，然后转化到E. coli DH5 α 化学感受态细胞中，在含有50 μ g/ml卡那霉素和25 μ g/ml博来霉素（zeocin, Invitrogin) 低盐LB培养基（其他成分和LB培养基相同，NaCl含量减半）中37°C，225rpm振荡培养过 夜。MI片段的具体结构见图2。
[0122] 2. 5 BsgI 去除 MI 右臂（图 3. c)
[0123] BsgI酶切（NEB，酶切位点为GTGCAG (N) 16丨/丨H(N)CTGCAC)上述步骤2. 4得到 的质粒，（见流程图），琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收大片段（即，大小为3. Ikb的片 段），此时的片段是两端各有2个伸出的核苷酸的粘性末端，由于BsgI酶属于IIs型限制性 内切酶，切割位置在识别位点之外，由于MI在整合酶基因插入位点的随机性，无法保证两 个粘性末端相同，因此需要用T4DNA聚合酶（Takara) 5' 一 3' DNA聚合酶活性和3' 一 5' DNA 外切酶活性，使得BsgI酶切后片段5'端突出末端补平或3'端突出末端削平，然后将所得 产物用T4DNA连接酶（Takara)自连，然后转化到E. coli DH5a化学感受态细胞中，在含有 50 μ g/ml卡那霉素的LB培养基中37 °C，225rpm振荡培养过夜。
[0124] 2. 6 BpmI 去除 MI 左臂（图 3. c)
[0125] BpmI (NEB，酶切位点为 CTGGAG (N) 16 I / I 14 (N) CTCCAG)，酶切上述步骤 2. 5