得到 的质粒，割胶回收大片段（即，大小为2. 9kb的片段），其余步骤同上一步。
[0126] 这一步得到的质粒包含用NNN替代了整合酶基因上随机3个碱基的突变体。 这一步可以得到至少5万个克隆，进一步对其中随机挑选的200个克隆送测序后发现， 77(38. 5% )个克隆含有无功能的突变，123^1. 5% )个克隆含有三个碱基的突变，突变碱 基的位置并无明显偏好性。当无法获得本发明所希望的结果时，可返回至转座反应，重新进 行操作，直至能获得一个突变分布均匀，且多样的突变库为止。
[0127] 3. Frame check
[0128] 由于IIs型限制性内切酶（BsgI和BpmI)反应时有一定的错误率，以及T4DNA聚 合酶在削平或补平粘性末端时也会出现多补或多削的情况，因此我们得到的整合酶的突变 体会有碱基的缺失或插入突变，会导致移码突变，另外也可能有终止密码子的出现，这些突 变是无功能的突变，表达出的整合酶有移码或者中断。对TDEM得到的突变库进行测序可 知，移码突变以及终止密码子的突变约占所有突变的38. 5%。本实验利用了 pFramecheck 质粒，剔除有移码突变及终止密码子的突变。
[0129] 3. I Frame check原理：基因突变体克隆到噬菌体fd衣壳蛋白信号序列gill以 及β -内酰胺酶（pFrameCheck示意图中的Ampicillin抗性基因）之间，如果突变的基因 有移码突变或者终止密码子，gill和β内酰胺酶不能连接，β-内酰胺酶就不能被转运到 细胞周质间隙，包含这个质粒的细菌就不能在氨苄青霉素的存在下存活，相反，可以存活下 来的细菌包含的质粒就是含有正确突变的质粒。
[0130] 3· 2 Frame check 流程：
[0131] (I)BsaI 酶切（酶切位点为 GGTCTC(N)1 丨 / 丨（N) 5GAGACC)质粒 pFramecCheck， 割胶回收大片段（即，大小为2. 9kb的片段），得到去除示意图中IacZa基因的线性片段。
[0132] (2) BsaI酶切（酶切位点为GGTCTC(N) i丨/丨（N) 5GAGACC)上述步骤2. 6得到的 含有突变整合酶基因的质粒，割胶回收〇. 9k的整合酶突变基因。
[0133] (3)将步骤（1)和步骤⑵得到的片段在T4DNA连接酶的催化下连接，转化到 E. coli DH5 α菌株化学感受态细胞中，100 μ 1涂布在含有50 μ g/ml卡那霉素和50 μ g/ml 氨苄青霉素的LB固体培养基上37°C放置过夜，其余900 μ 1在含有50 μ g/ml卡那霉素和 50 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中37 °C，220rpm振荡培养过夜。这样得到的质粒去除了 含有移码突变或终止子的突变。在此步得到的大约5万个克隆中随机挑取40个克隆进行 测序后发现40个克隆中都是只有3个碱基的交换突变，翻译成氨基酸时表现为一个或两个 连续的氨基酸发生替换，并且突变位点并无重复，测序结果是（数字代表发生替换突变的 氨基酸的位点，数字前字母为野生型整合酶此位点的氨基酸简称，数字后字母为突变后此 位点氨基酸的简称）：
[0134] K7D/A8C, K7I/A8S, Y15C, V31P, A38C, C56W/S57R, I73F, V77C, V79I, V79L, A79S, A80 S, S81I/G82R, Y83N, E85V, F100L/L101V, F100I, D116E,T124A,I141M/P142V,I141S/P142S, S153A,A169V, H171P, T174V, Q177S, L213F, R228T, P238V, Q252H/D253H, D253/N254Y, N254I, S255R,D256W, I267L, I268Q,E270Q,Y271W/G272R，D278E/D279I，D288A ;此结果中氨基酸替 换突变的位点比较均匀的分布在整合酶基因上，并且某一位点氨基酸可以替换成不同的氨 基酸（位置79上的V可以突变为I也可突变为L或S)。这些测序结果说明frame check 步骤去除移码突变及终止密码子的效果是很明显的，而且可以证明：采用本发明的方法能 获得多样的整合酶突变库。
[0135] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. HIV-I整合酶突变体库的构建法，其特征是包括如下内容： (1) 、利用转座子的转座，以及转座子两端限制性内切酶在目的基因随机位点制造空 隙，插入突变插入盒，再利用盒上的限制性内切酶位点，通过酶切自连，实现目的基因上3 个碱基的替换，目的基因翻译成蛋白后，造成目的蛋白上一个或连续两个氨基酸的突变； (2) 、利用定点突变PCR，使突变插入盒上的用于替换原目的基因3个碱基的3个碱基， 由编码半胱氨酸的密码子突变为编码其他19个氨基酸的密码子，从而来增加最终突变库 的多样性。2. 根据权利要求1所述的HIV-I整合酶突变体库的构建法，其特征是包括如下步骤： 一、 质粒的构建： 1) 、质粒pCompact-Kana-IN的构建，包括以下步骤： ① 、质粒pCompact-Kana的构建： 片段Origin和片段Kanamycin R，由T4DNA连接酶催化连接得到质粒pCompact-Kana ; ② 、质粒pCompact-Kana-IN的构建： 以pCompact-Kana为模板，扩增获得载体片段； 整合酶片断和载体片段由T4DNA连接酶催化连接，得质粒pCompact-Kana-IN; 2) 、质粒pMutationinsert的构建，包括以下步骤： ① 、Zeocin片段和Origin片段，由T4DNA连接酶催化连接； ② 、PCR扩增质粒stuffer部分； ③ 、以上述步骤①的连接产物为模板进行PCR，得到Origin和Zeocin两个片段的连接 片段； ④ 、以步骤③扩增所得的片段、步骤②所得的stuffer片段，由T4DNA连接酶催化连接， 得到质粒 pMutationinsert ; 3) 、质粒pFrameCheck的构建，包括以下步骤： ① 、片段载体部分（pCompact-Kana)，E. coli乳糖启动子（Plac)，丝状菌体fd次要 衣壳蛋白的gill信号序列（gill)，填充基因（stuffer)，以及0 -内酰胺酶基因（Amp-R) 分别进行PCR反应扩增； ② 、5个片段依次连接，得质粒pFrameCheck ; 二、转座子导向的碱基替换突变方法： 1) 、转座反应： 为了表达Nd-MuA，包含Nd-MuA的质粒通过转化进入E. coli BL21(DE3)RIL感受态细胞 中，诱导Nd-MuA的表达； 再利用纯化后的Nd-MuA催化Mu转座子转座进入包含目的基因HIV-I整合酶基因的质 粒 pCompact-Kana-IN 中； 2) 、去除转座子插入质粒载体的转座； 得到转座子插到整合酶的转座产物； 3) 、去除转座子： 用NotI酶切步骤2)得到的转座产物，琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收大片段，将 得到整合酶随机位置断开的线性DNA ; 4) 、插入MI替代转座子： 片段Zeocin，NNN以及stuffer片段组成了 MI片段； 用T4DNA连接酶将所述线性DNA和MI片段连接； 5) 、BsgI去除MI右臂： BsgI酶切上述步骤4)得到的质粒，琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收大片段； 并使得BsgI酶切后片段5'端突出末端补平或3'端突出末端削平，然后将所得产物用 T4DNA连接酶（Takara)自连； 6) 、BpmI去除MI左臂： BpmI酶切上述步骤5)得到的质粒，得到含有突变整合酶基因的质粒；从而获得突变分 布均匀、且多样的突变库。3. 根据权利要求2所述的HIV-I整合酶突变体库的构建法，其特征是还包括如下步 骤： 三、利用PFramecheck质粒，剔除有移码突变及终止密码子的突变。4. 根据权利要求3所述的HIV-I整合酶突变体库的构建法，其特征是： 所述步骤三包括以下步骤： (1) 、BsaI酶切质粒pFramecCheck，割胶回收大片段，从而得到去除IacZ a基因的线性 片段； (2) 、BsaI酶切所述含有突变整合酶基因的质粒，割胶回收0. 9k的整合酶突变基因； (3) 、将步骤（1)和步骤（2)得到的片段在T4DNA连接酶的催化下连接，转化到E. coli DH5a菌株化学感受态细胞中，涂布在含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml氨苄青霉素的 LB固体培养基上；从而使所得的质粒去除了含有移码突变或终止子的突变。
【专利摘要】本发明公开了一种HIV-1整合酶突变体库的构建法，包括如下内容：(1)、利用转座子的转座，以及转座子两端限制性内切酶在目的基因随机位点制造空隙，插入突变插入盒，再利用盒上的限制性内切酶位点，通过酶切自连，实现目的基因上3个碱基的替换，目的基因翻译成蛋白后，造成目的蛋白上一个或连续两个氨基酸的突变；(2)、利用定点突变PCR，使突变插入盒上的用于替换原目的基因3个碱基的3个碱基，由编码半胱氨酸的密码子突变为编码其他19个氨基酸的密码子，从而来增加最终突变库的多样性。
【IPC分类】C12N15/63, C40B50/06, C12N15/66
【公开号】CN104975353
【申请号】CN201510310101
【发明人】周亚夫, 杨立莉, 沈学彬, 叶剑
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年6月8日