一种缩氨脲类化合物的制备方法和在生物医学方面的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化学领域，具体的，本发明涉及化合物及其制备方法和应用，更具体 的，本发明涉及式I所示化合物以及衍生物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 铜锌超氧化物歧化酶（SODl)是一种生物体内具有重要抗氧化功能的金属酶，金 属辅基锌和铜决定该酶的结构和活性。Cu2+直接参与催化反应，而Zn 2+维持酶的构象，不直 接参与反应；但Cu2+和Zn2+对于SODl结构的稳定性是不可或缺的，螯合剂与SODl相互作用 后，形成脱辅基的SODl，其结构发生变化，加入过量的Zn2+可以使SODl的结构恢复，但Cu 2+是不可替代的，否则SODl将失去催化活性。金属结合部位的环境被破坏，SODl的整体结构 及功能都可能发生变化。
[0003]目前关于SODl与人类疾病之间的关系研究最广泛的是肌萎缩脊髓侧硬化症 (Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)，该病目前尚无有效治疗的方法和药物，为全球五 大绝症之一（另外四种为癌症、艾滋病、败血症以及类风湿）^3ALS是一种导致运动神经元死 亡的致死性神经退行性疾病，随着疾病的发展，大脑和脊髓中的运动神经元收缩甚至消失， 肌肉因不能收到运动信号而萎缩，患者脊髓侧索部位逐渐变硬，身体随之麻痹甚至瘫痪，故 又称ALS为"渐冻症"。据新华网搜索结果显示，我国目前至少有20万名ALS患者，远高于 全世界约5/100, 000的平均患病率。ALS病理过程对运动神经元的损伤涉及多种原因，大量 证据表明SODl过量表达会导致严重的炎症，损伤运动神经元，从而导致ALS。
[0004] 同时，已经有大量研究结果表明体内活性氧自由基过多会引起机体组织中细胞 损伤，导致多种疾病发生和发展，甚至死亡。因此，要对胞内活性氧（Reactive oxygen species，R0S，主要是02'和H2O2)相对浓度进行有效的调控，此调控的关键之一是合理抑 制SODl的活性。目前该酶最有效的抑制剂是铜螯合剂，这主要是因为铜螯合剂通过夺取 SODl活性部位中的铜，从而使其失活。
[0005] 铜作为人体必须的微量元素之一，维持其在体内平衡十分重要。微量元素铜在 人体细胞内发挥重要生理功能，维持细胞内铜的稳态平衡，其代谢也至关重要。铜代谢紊 乱能引发多种疾病，如阿尔茨海默氏症（Alzheimer' s disease，AD)、Menkes病（Menkes disease，MD)、威尔森氏症（Wilson' s Disease，WD)等。
[0006] AD是一种常见的神经退行性疾病，主要表现为记忆力下降、思维能力下降、行为异 常、性格改变等。Menkes病（Menkes disease，MD)又称卷发综合征，是一种先天性铜代谢 异常疾病。威尔森氏症（Wilson' s Disease，WD)是由于ATP7B基因突变导致铜转运障碍 而引起的，是一种常染色体隐性遗传性铜蓄积性疾病。
[0007] 目前对于螯合剂类SODl抑制剂的研究和报导主要集中在四硫代钼酸盐（MoS42， 如TM，衍生物ATN224等）和二乙胺二硫代氨基甲酸盐（如DDC)两类。四硫代钼酸盐类 (MoS42)螯合剂与金属离子具有很强结的螯合能力，是一种可口服的铜螯合药物，被认为能 够有效治疗铜代谢紊乱病症，但与铜离子形成的配合物在体内不易代谢。MoS42在抗癌细胞 增殖和抗血管生成治疗中已完成二期临床实验。MoS42的抗癌活性源于螯合SODl中的铜从 而抑制S0D1，即SODl是MoS42抗癌的主要作用靶标，主要通过螯合细胞膜上铜传输蛋白中 的铜离子，阻断新合成的SODl获得铜离子而活化，从而降低胞内的SODl的活性。二乙基 二硫代氨基甲酸钠（DDC)是SODl的抑制剂，研究表明，DDC能够螯合溶液里SODl中77%的 铜和44%的锌，使SODl失去催化活性，在细胞培养液中加入一定量的DDC有明显抑制癌细 胞分裂、增殖的作用。然而同时也发现MoS42和DDC对SODl活性的抑制缺乏特异性，对胞 内其它含铜蛋白的活性影响较为明显，例如MoS42在抑制SODl活性的同时能明显抑制细胞 色素 c氧化酶的活性。另外，MoS42和DDC对铜离子的螯合能力过于强大导致破坏胞内铜离 子的内稳态，螯合形成的铜配合物在体内不易代谢，在体内富集造成二次伤害。
[0008] 已有研究报道的螯合剂作为SODl活性抑制剂仅上述2例，它们虽然能有效的抑制 SODl活性，但存在明显的缺陷：（1)带负电荷，无法跨越血脑屏障和细胞膜；（2)缺乏特异 性，导致细胞内其它含铜蛋白活性受到不同程度的影响。目前的研究结果还不能表明这两 类螯合剂能选择性地螯合SODl中的铜离子使SODl失活。
[0009] 目前在细胞内能够特异性抑制SODl活性的抑制剂尚未见报导。现有研究的螯合 剂类SODl抑制剂虽然能抑制其酶活性，但存在的缺陷亦十分明显，甚至成为后期药物研发 中的技术瓶颈。因此有必要开发抑制效果明显、毒副作用小、特异性显著的新型SODl抑制 剂。
【发明内容】
[0010] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的 目的在于提出一类具有SODl抑制剂用途的化合物。
[0011] 在本发明的第一方面，提供了一种化合物。根据本发明的实施例，该化合物为式 I所示化合物或式I所示化合物的对映异构体、非对映异构体、外消旋体、药学上可接受的 盐、结晶水合物或溶剂合物，
[0012]
[0013] 其中，
[0014] X为硫或氧；
[0015] R1和R2分别独立地为氢，含有1~3个碳原子的烷基或N = CHR 5,其中R5为任选 取代的芳香基或任选取代的烷基；
[0016] R3和R4分别独立地为氢或含有1~3个碳原子的烷基或选自式II、III、IV、V所 示取代基：
[0017]
[0018] 其中，
[0019] X1为硫或氧；
[0020] Y31和Y2分别独立地为氢、含有1~3个碳原子的烷基、卤素、羟基、甲氧基、氨基、 磺酸基、硝基、羧基、巯基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基或者二乙氨基中的至少一个；
[0021] Z1为氢、含有1~3个碳原子的烷基、卤素、羟基、氨基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基 或者二乙氨基；
[0022] 发明人惊奇地发现，在一个具体实施方案中，通过配合物稳定常数计算、配合物的 结构分析及细胞跨膜实验研究发现本发明所述通式（I )所示系列化合物容易穿透细胞 膜进入细胞，且对铜离子有良好的螯合能力，形成的配合物结构稳定，对正常细胞系毒性较 低。因此本发明提供了通式（I )所示系列化合物在治疗铜代谢紊乱药物中的应用。所述铜 代谢紊乱病症为阿尔茨海默氏症（Alzheimer's disease，AD)、Menkes病（Menkes disease， MD)及威尔森氏症（Wilson' s Disease，WD) 〇
[0023] 根据本发明的实施例，上述化合物还可以具有下列附加技术特征：
[0024] 根据本发明的一个实施例中，所述卤素为F、Cl或Br。
[0025] 根据本发明的一个实施例中，所述R1和R2分别独立地为至少一个氢，R 5为苯基、 4-甲基苯基、2_羟基苯基、3_羟基苯基、4_羟基苯基、2_羟基_5_氣苯基、2_羟基_4_氣苯 基、3_甲氧基苯基、4_氣苯基、2_氣苯基、2, 4_二氣苯基、3_漠苯基、4_漠苯基、4_氣苯基、 3-氟苯基、4-三氟甲基苯基、吡咯、邻位吡啶、间位吡啶、对位吡啶。
[0026] 根据本发明的一个实施例中，所述R3、R4和R 5分别独立地为含有1~3个碳原子 的烷基。
[0027] 根据本发明的一个实施例中，所述化合物为下列化合物或者所述下列化合物的对 映异构体、非对映异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、结晶水合物或溶剂合物：
[0028]
[0029] 在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备前面所述化合物的方法，根据本发 明的实施例，该方法包括：
[0030] 使式A所示化合物在第一有机溶剂中与式IIA，IIIA，IVA或VA所示化合物接触以 便获得式I所示化合物；
[0031]
[0032]
[0033] 其中所述R1和R 2分别独立地为氢，含有1~3个碳原子的烷基、R ?χα^Υ』1、 Y2和Z1是如是如前面所描述的。
[0034] 任选地，第一有机溶剂为DMSO、DMF、乙腈、异丙醇中的至少一种；
[0035] 任选地，所述接触是式ΙΙΑ，ΙΙΙΑ，IVA或VA所示化合物的第一有机溶剂溶液滴加 至式A所示化合物和第一有机溶剂的溶液中，滴加速率不大于l.OmL/min ;
[0036] 任选地，重结晶提纯，所述重结晶提纯的溶剂为DMF或DMSO与水的混合溶剂；
[0037] 任选地，所述重结晶提纯步骤中水为去离子水。
[0038] 根据本发明的实施例，该方法进一步包括：
[0039] (1)使式A'所示化合物在第二有机溶剂和水的混合溶剂中与式B所示化合物接 触，以便获得式C所示化合物；
[0040] (2)使所述式C所示化合物在第一有机溶剂中分别与式IIA，IIIA，IVA或VA所示 化合物接触以便获得式I所示化合物；
[0042] 其中所述R1和R2分别独立地为氢，含有1~3个碳原子的烷基且至少一个为N = CHR5、R3、R4、X、X1、Y、Y 1、Y2和Z 1是如前面所描述的
[0043] 任选地，第一有机溶剂为DMSO、DMF、乙腈、异丙醇中的至少一种；
[0044] 任选地，第二有机溶剂为甲醇、乙醇、DMF、乙腈、DMSO中的至少一种；
[0045] 任选地，所述步骤（2)中反应温度为20-80°C
[0046] 任选地，所述步骤（2)中接触是式IIA，IIIA，IVA或VA所示化合物的第一有机溶 剂溶液滴加至式A所示化合物和第一有机溶剂的溶液中，滴加速率不大于l.OmL/min ;
[0047] 任选地，重结晶提纯，所述重结晶提纯的溶剂为DMF或DMSO与水的混合溶剂；
[0048] 任选地，所述重结晶提纯步骤中水为去离子水。
[0049] 由此，根据本发明的实施例，本发明提出了一条合成路线，可以用于制备式I所示 化合物1 :
[0053] 步骤1，室温下将过量硫代卡巴肼溶于乙醇/水混合溶剂中，加热至60_90°C全部 溶解。再用恒压滴管将5-氯水杨醛的乙醇溶液缓慢滴加到上述溶液。滴加催化量的冰醋 酸并恒温反应l_2h，得到白色不溶物，抽滤，收集并用乙醇、去离子水淋洗，干燥。
[0054] 步骤2,将三氯氧磷在冰浴条件下缓慢滴加到DMF中，然后再将邻羟基苯乙酮的 DMF溶液以低于1.0 mL/min的速率缓慢滴加至混合液中，升温至25°C反应10h，反应结束后 冷却至室温。将反应混合物倒入冰水中，将产生的黄色沉淀抽滤，纯化得白色晶体。
[0055] 步骤3,将步骤2所得产物溶于DMSO中，依次加入步骤1所得产物及催化量冰醋 酸，45°C反应lh，反应结束后在室温下加入3-5倍体积去离子水，将沉淀物过滤，并先后用 去离子水、无水乙醇（甲醇）淋洗2-3遍，干燥得到初产品。将初产品溶于DMSO中，在试管 中缓慢滴加去离子水，静置扩散，重结晶析出针状晶体。
[0056] 在本发明的第三个方面，本发明提供了前面所述的化合物或（SODl)活性抑制剂 或者在制备药物中的用途，在制备铜锌超氧化物歧化酶（SODl)活性抑制剂的用途，任选 地，所述铜锌超氧化物歧化酶（SODl)活性调控胞内活性氧（ROS)浓度水平，任选地，所述活 性氧（ROS)为O2'及H2O2。化合物可以用于制备药物中，所述药物用于治疗上运动神经元 和下运动神经元损伤、神经细胞康复治疗以及治疗慢性退行性神经系统变性疾病，任选地， 所述神经退行性疾病为肌萎侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)。所述药 物用于治疗或辅助治疗铜代谢紊乱病症，任选地，所述铜代谢紊乱病症为阿尔茨海默氏症 (Alzheimer' s disease，AD)、Menkes 病（Menkes disease，MD)及威尔森氏症（Wilson' s Disease, WD) 〇
[0057] 在一个具体实施方案中，通过SODl活性抑制试验、细胞内SODl活性抑制试验，发 现本发明所述通式I所示化合物通过螯合金属离子抑制SODl的活性。细胞内的SODl活性 抑制试验进一步证明该类化合物能有效的抑制细胞内SODl的活性。因此，本发明提供的通 式I所示化合物在抑制SODl活性，治疗神经元疾病药物研发中有良好的应用前景。所述神 经性疾病为肌萎侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS) ο
[0058] 在一个具体实施方案中，通过对细胞内活性氧（ROS)浓度水平的检测分析，发现 Η202的水平相对于对照组明显降低，且H2O2的浓度水平变化与加入的目标化合物浓度呈递 度递减关系；同时，胞内〇2'水平的变化也随优选化合物浓度梯度的递增十分明显。通过 分析胞内活性氧R0S(02'和H2O2)浓度变化随优选化合物浓度之间的关系，证实本发明所述 缩氨脲类化合物能够调控胞内活性氧R0S(02'和H2O2)的浓度水平。因此，本发明提供的通 式I所示化合物在调控胞内活性氧（〇2'和H2O2)水平的药物研发方面有良好的应用前景。
[0059] 在一个具体实施方案中，通过对细胞线粒体中的细胞色素 C氧化酶活性的测试， 发现本发明所述通式I所示化合物在显著抑制SODl酶活性的同时不影响细胞色素 c氧化 酶的活性。因此，本发明提供的通式I所示化合物在抑制SODl活性的同时不影响其它含铜 蛋白活性，即说明通式I所示化合物对细胞内铜离子的传输途径没有影响。
[0060] 本发明所述通式I所示缩氨基硫脲类化合物可以作为铜锌超氧化物歧化酶 (SODl)抑制剂和可能在治疗铜代谢紊乱药物上的潜在应用，具有调控体内活性氧（R0S，主 要为〇2'及H2O2)水平的作用。本发明通式I所示化合物制备方法，操作简单，原料易得，反 应条件温和，提纯方便，可用于通式I所示缩氨脲类化合物的大量制备。
【附图说明】