age display peptide library)购自 NewEngland Biolabs 公司，IOOul，I. 5X 1013pfu/ml，复杂度 2· 7X 109 个转 化子，贮存于含50 %甘油的TBS溶液中。
[0039] (3)-28gIII测序引物：5'-H0GTA TGG GAT TTT GCT MA CAA C-3'，lOOpmol，lpmol/ μ I
[0040] (4)-96gIII 测序引物：5' -HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'，lOOpmol，lpmol/ μ I
[0041] ⑶宿主菌：Ε· coli ER2738 宿主菌，购自 New England Biolabs 公司 F? IacIqA (IacZ)M15proA+B+zzf::Tn 10(TetR)/fhuA2supE thiΔ (lac-proAB)〇
[0042] 二、主要实验试剂
[0043] 胰蛋白陈、酵母提取物：购自OXOID公司
[0044] 琼脂糖、琼脂粉：购自广东环凯微生物科技有限公司
[0045] PEG8000、Tris、BSA :购自北京鼎国生物有限公司
[0046] IPTG、Xgal :购自北京鼎国生物有限公司
[0047] 四环素：购自北京鼎国生物有限公司
[0048] Tween20 :购自天津市福晨化学试剂厂
[0049] 多聚甲醛：购自北京鼎国生物有限公司
[0050] HRP/anti_M13 antibody :购自 Amersham Biosciences 公司
[0051] TMB :购自北京鼎国生物有限公司
[0052] Tris-饱和酚：购自北京鼎国生物有限公司
[0053] Tris碱：购自北京鼎国生物有限公司
[0054] EDTA :购自北京鼎国生物有限公司
[0055] 三、主要工作液配制
[0056] (I)PBS :称取下列试剂，置于 IL 烧杯中：8. 00g NaCl、2. 90g Na2HP04 · 12H20、 0.20g KCl、0.20g KH2P04;加入约800ml三蒸水，充分搅拌溶解，定容至1000ml;高压或 0. 22 μ m滤膜过滤除菌，4°C保存。
[0057] (2) LB 培养基：称取 IOg Bacto-Tryptone，f5g yeast extract, f5g NaCl，加入约 800ml三蒸水，充分搅拌溶解，定容至1000ml。高压灭菌，室温贮存。
[0058] (3)LB/IPTG/Xgal平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70°C时， 加入1ml IPTG/Xgal，混匀倒平板。平板4°C避光贮存。
[0059] (4)顶层琼脂：称取 IOg Bacto-Tryptone，f5g yeast extract, f5g NaCl, Ig MgC12. 6H20, 7g琼脂粉，加入约800ml三蒸水，充分搅拌溶解，定容至1000ml。高压灭菌，分 成50ml等份。固体培养基室温贮存，用时微波炉融化。
[0060] (5)四环素贮液：以20mg/ml的浓度溶于乙醇中。-20°c避光贮存。用前摇匀。
[0061] (6) LB-Tet平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70°C时，加入 Iml四环素贮液，混匀倒平板。平板4°C避光贮存，如果平板显棕色或黑色请勿用。
[0062] (7)封阻缓冲液：0· IM NaHC03 (pH 8. 6)，5mg/ml BSA, 0· 02% NaN3。过滤除菌，4°C 贮存。
[0063] (8)TBS :50mM Tris-HCl(pH 7· 5)，150mM NaCl。高压灭菌，室温贮存。
[0064] (9)PEG/NaCl :2〇% (w/v)PEG_8〇00, 2. 5M NaCl。高压灭菌，室温贮存。
[0065] (10)链霉亲和素贮液：将I. 5mg链霉亲和素冻干粉（本试剂盒提供）溶于ImllOmM 磷酸钠（pH7. 2) UOOmM NaCl、0. 02% NaN3溶液中。4°C或_20°C贮存，避免反复冻融。
[0066] (11) IPTG/Xgal :称取 I. 25g IPTG (isopropyl β -D-thiogalactoside)和 IgXgal ( 5-Brom〇-4-chlor〇-3-indolyl- β -D-galactoside)溶于 25ml 二甲基甲醜胺中。溶液-2CTC 避光贮存。
[0067] (12) IM Tris-HCI (ρΗ9· 1)中和缓冲液：150ml 去离子水溶解 24. 22g Tris 碱，用浓 HCI调节pH值至9. 1，加水至200ml，过滤除菌，4°C贮存。
[0068] (13) (λ 2M Gly-Hcl (ρΗ2· 2)洗脱缓冲液：900ml 去离子水溶解 L 4g Glycine，用浓 HCI调节pH值至2. 2,加水至1000ml，过滤除菌，4°C贮存。
[0069] (14)4%多聚甲醛：称取多聚甲醛4g，加入80ml PBS，水浴锅50°C加热溶解后，PBS 定容至100ml。
[0070] (15)0· 1 % Triton :先将100% Triton配成30%保存，需要时现配现用。
[0071] (16)0. 05 % PBST :称取下列试剂，置于 IL 烧杯中：8. 00g NaCl， 2. 90gNa2HP04 · 12H20,0. 20g KC1，0. 20g KH2P04 ;加入约 800ml 蒸馏水，充分搅拌溶解，定 容至1000ml，加入0.5ml Tween 20摇勾，现配现用。
[0072] (17)2% BSA :2g BSA 溶解在 100ml PBS 中，现配现用。
[0073] (18)HRP/anti-M13antibody :用 2% BSA I :5000 稀释，每 20ml BSA 加入 5 μ 1 抗 体。
[0074] (19) TMB 反应液：Α 液：TMB lmg/ml DMS0, B 液：柠檬酸： 1.028/1001111似即04-12!120:3.688/1001111?!1 :5.0-5.4，(：液：30%过氧化氢4:8:〇=100 : 900 :1，50 μ 1/孔，显色 8-15 分钟。
[0075] (20) TMB 反应终止液：2M HCl。
[0076] (21) TE (ΡΗ8. 0):称取 IOmmol Tris-base、lmmol EDTA用 800ml ddH20 溶解，定容， 用HCl调pH至8. 0,灭菌。
[0077] (22)乙酸钠：无水乙醇：将3mol/L乙酸钠（已过滤）与无水乙醇按1:25的体积 比混匀。
[0078] (23) 70%冷乙醇：将无水乙醇用灭菌水稀释成70%，-20°C保存备用。
[0079] 四、实验方法：
[0080] I、HR4单克隆抗体IgG纯化实验
[0081] Anti_HR4antibody (abl78704)单克隆抗体进行前期 ProteinA/G 纯化。
[0082] 2、受体菌E. coli ER2738的复苏及培养
[0083] 从E. coli ER2738的甘油冻存物中挑取一接菌环，涂布于LB-Tet平板上，37°C颠 倒培养过夜后，挑取单一菌落，置于20ml含有lug/ml Tet的LB培养液中，37°C振荡培养过 夜，使0D600值达0. 6左右（实测值：0. 612)。LB-Tet平板及细菌扩增液置于4°C保存，备 用。
[0084] 3、噬菌体扩增
[0085] 挑取ER2738单菌落置于20ml LB培养液中，37°C振荡培养过夜，使0D600值 达0. 6左右，加入噬菌体液10 μ l，250rpm，37°C摇床培养4. 5-5h ;培养物转入离心管中， lOOOOrpm，离心5min，将80%上清转入新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，37°C沉淀过夜， lOOOOrpm，离心10min，沉淀用Iml TBS重悬，此即为扩增噬菌体贮液，可以4°C贮存几个星 期而对滴度影响不大。
[0086] 4、噬菌体滴度的测定
[0087] 受体菌ER2738培养至对数中期（0D600实测值：0.496)，分成200 μL每等份；将待 测噬菌体用LB培养基进行100倍比稀释（稀释方法：首先取10 μ L待测噬菌体，加 LB培 养基稀释至lmL，混匀，标记为管①；从管①中取10 μ L至新的离心管中，加 LB培养基稀释 至lmL，混匀，标记为管②；从管②中取10 μ L至新的离心管中，加 LB培养基稀释至lmL，混 匀，标记为管③；依次稀释。每浓度取10 μ L与对数生长早期的ER2738菌液200 μ L混匀， 加入到3mL于45°C保温的LB顶层琼脂后迅速倾倒于含有IPTG/Xgal的LB固体平板，37°C 过夜，计数蓝色噬菌斑。计算公式：噬菌体效价（pfu/10 μ L)=噬斑数X稀释倍数，即每 10 μ L的噬菌体形成单位。
[0088] 噬菌体滴度测定结果为：在1014稀释倍数平板，噬菌斑数计数为330个左右，根据 公式计算效价为：3. 3x 1016pfu。
[0089] 5、噬菌体12肽库的筛选
[0090] ⑴筛选前一天在96孔板中按照40 μ g/孔加入纯化后的HR4单克隆抗体，4°C孵育 包板过夜。
[0091] ⑵弃去包被液，加入1% BSA，37°C封闭2h;加入噬菌体12肽库（滴度约为 2x101 lpfu)，37°C孵育 lh。
[0092] (3) TBST (0· 1 % )冲洗 6 次，lmin/ 次。
[0093] ⑷用Iml甘氨酸洗脱缓冲液（PH2. 2)冰上洗脱lOmin，加入150 μ 1洗脱液 Tris-HCL(ΡΗ9. 1)中和，收集上清