：
[0230]RNA5yg，引物（oligodT) (1yg/y1) 1yL，DEPC水至 13yL
[0231] ②将上述混合物置于PCR仪中，65°C10分钟，立即冰上冷却2分钟，短暂离心收集 液体。
[0232] ③在每个退火反应混合物中加入
[0233]
[0234] 混匀上述混合物（20yL)，短暂离心收集液体。
[0235]④ 42°C孵育 60min。
[0236]⑤70°C作用10min(降解RNA链）。
[0237] ⑥以上产物为模板，按照试剂盒说明书步骤进行RT-PCR实验。
[0238]⑦取0?5ulRT产物运用SYBR?PremixExTaqTM(TaKaRa)进行实时定量PCR 反应。反应条件如下：
[0239]
[0240]ThermalCycling
[0241]⑴94°C 4min
[0242]⑵94°C 30sec
[0243] 56 °C 60sec
[0244] 72 °C 40 sec
[0245] 40cycles
[0246] 数据处理：
[0247]Folds=AACt
[0248]其中AACt= (Ctl-Ct2)-(Ct3_Ct4)
[0249] Ctl:处理样品待测基因的临界循环数
[0250]Ct2:处理样品内参基因的临界循环数
[0251]Ct3:对照样品待测基因的临界循环数
[0252]Ct4:对照样品内参基因的临界循环数
[0253] 如图8所示，实验结果表明与对照疫苗相比，PT1疫苗治疗及预防组IFN-r，IL-2表 达水平均上调，IL-6表达水平下调。
[0254] 2. 7ELISA检测支气管灌洗液与HRH4的结合
[0255] 实验方法同2. 4。
[0256] 如图9所示，实验结果表明与对照疫苗及正常大鼠相比，在气道中，PT1疫苗治疗 及预防组均可以产生特异性抗体并与人HRH4结合。
[0257] 2. 8Real_timePCR检测黏膜组织中IFN-r，IL-2,IL-6 表达水平
[0258] 实验方法同2. 4。
[0259] 如图10,实验结果表明与对照疫苗相比，PT1疫苗治疗及预防组IFN-r，E-2表达 水平均上调，IL-6表达水平下调。
[0260] 2. 9Western_blotting检测黏膜组织中IFN_r,IL-2,IL-6 表达水平
[0261] ①蛋白裂解物的获取：从液氮中取出组织块，加入200ul裂解液，研磨至组织无肉 眼可见碎片；吸取组织悬液至EP管中，用200ul裂解液冲洗研磨器，把组织混悬液尽量都冲 下来，吸入EP管中，重复一次，共600ul组织混悬液，冰上裂解lh;4°C，20,OOOg离心30分 钟，取上清即为总蛋白，-80 °C保存。
[0262] ②SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白：配制分离胶为10%的SDS-PAGE凝胶。取32y1 总蛋白+8y1的5XLoadingBuffer经煮沸3分钟后立即冰置3分钟后，上样。100V电压 电泳。
[0263]③电转膜：电泳分离后的蛋白电转至硝酸纤维素膜上（Millipore，USA)， 350mA, 120min，在 4°C进行。
[0264] ④封闭：将硝酸纤维素膜做标记以区分正反面及左右侧，浸入Blotto封闭液中， 室温摇床上轻轻摇动1. 5小时。
[0265] ⑤与一抗的结合：在摇床上4°C轻轻摇动过夜。
[0266] ⑥在1XTBST中摇动浸洗3次X5分钟，洗去非特异结合的一抗。
[0267] ⑦与二抗的结合：将上膜和下膜分别浸入含相应HRP-羊抗兔IgG的Blotto中，室 温轻轻摇动2小时。
[0268] ⑧在1XTBST中摇动浸洗3次X5分钟，洗去非特异结合的二抗。
[0269] ⑨最后用WesternLightning?.-ECL,EnhancedChemiluminescence Substrate(PerkinElmer，NEL100001EA)检测，显影。
[0270] 如图11所示，实验结果表明与对照疫苗相比，PT1疫苗治疗及预防组IFN-r，IL-2 表达水平均上调，IL-6表达水平下调。
[0271] 综上，本发明的有益效果如下：本发明利用噬菌体随机十二肽库技术筛选HR4表 位模拟肽的多肽序列，ELISA鉴定噬菌体单克隆对HR4单抗的亲和力，测序获得1条多肽， 其氨基酸序列为：FNKWMDCLSVTH，进一步鉴定噬菌体阳性克隆的靶向性结果提示噬菌体阳 性克隆能够特异性结合人HR4单克隆抗体，筛选获得的人HR4单克隆抗体特异性多肽，进而 构建HR4表位模拟肽疫苗，本发明HR4表位模拟肽疫苗，对于在临床上治疗肥大细胞的趋化 以及变应性鼻炎及变应性气道炎症具有重要意义，为了进一步的HR4拮抗剂的研制方面打 下良好的基础，为其构建工作提供初步的实验依据。
[0272] 需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实 体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存 在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语"包括"、"包含"或者其任何其他变体意在涵 盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要 素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备 所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句"包括一个……"限定的要素，并不排除 在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0273] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述实施例 对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施 例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者 替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
【主权项】
1. 一种HR4表位模拟肽，其特征在于，利用噬菌体随机十二肽库筛选得到多肽片段，其 氨基酸序列为：FNKWMDCLSVTH。2. -种如权利要求1所述的HR4表位模拟肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： 51、 HR4单克隆抗体IgG纯化，用pH值为6. 9~7. 1的20mmol/L磷酸缓冲液稀释HR4 单克隆抗体，并包被ELISA板； 52、 用封闭缓冲液室温封闭，用TBS和Tween20的混合液进行洗涤； 53、 向包被有单克隆抗体的微孔中加入筛选用噬菌体，缓慢振摇，使噬菌体与包被抗体 充分接触，用TBS和Tween20的混合液洗涤去除未结合的噬菌体； 54、 用甘氨酸-盐酸缓冲液室温洗脱结合的噬菌体，中和液中和后在宿主菌大肠杆菌 ER2738中扩增噬菌体，作为下一轮筛选的投入物，同时测定洗脱物和投入物的滴度； 55、 重复上述步骤共进行三轮筛选，从第三轮筛选后的洗脱物滴定平板中随机挑选30 个噬菌体克隆，进行噬菌体ELISA、噬菌体微筛选，得到本发明物。3. 根据权利要求2所述的HR4表位模拟肽的筛选方法，其特征在于，步骤Sl中所述磷 酸缓冲液pH为7. 0。4. 根据权利要求2所述的HR4表位模拟肽的筛选方法，其特征在于，步骤S4所述甘氨 酸-盐酸洗脱缓冲液PH为2. 7。5. 根据权利要求1~4任一所述的HR4表位模拟肽疫苗的构建方法，其特征在于，包括 以下步骤： 51、 HRH4的模拟表位PTl的人工合成，按照上述的多肽表位氨基酸序列结果，采用固相 合成法合成多肽表位PTl (FNKffMDCLSVTH)合成由辉源生物科技（上海）有限公司，纯度为 98%以上，同时合成对照多肽； 52、 PTl与HRH4单抗特异性结合实验，以2mg/L PTl和对照多肽包被96孔酶联板，每 孔100 y 1，4°C孵育过夜，倾去包被液，于每孔中加入封闭液，4°C封闭2h，倾去封闭液，TBST 洗6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体，将人HRH4单克隆抗 体，人CEA单克隆抗体分别加入对应的孔中，室温反应lh，TBST洗6次，各孔分别加入HRP 标记羊抗兔IgG或HRP标记羊抗鼠IgG，室温孵育lh。TBST洗3次，Imin/次，用TMB显色， HCl终止反应，酶标仪450nm处读数； 53、 构建PTl-CTB-脂质体复合物，以0. 9 %无菌氯化钠溶液溶解多肽和CTB，然后加入 相同体积的脂质体Lipofect，使每200 y 1含多肽100yg，含CTB 5yg，4°C静置过夜，次日 晨取出，升至室温（25°C )，即可。6. 根据权利要求5所述的HR4表位模拟肽疫苗，其特征在于，所述HR4表位模拟肽疫苗 用于治疗应变性的过敏性疾病。
【专利摘要】本发明公开了一种利用噬菌体抗体库针对人组胺受体4(HR4)表位模拟肽筛选及其疫苗构建方法，利用噬菌体随机十二肽库筛选得到1条多肽片段，其氨基酸序列为：FNKWMDCLSVTH。本发明利用噬菌体随机十二肽库技术筛选HR4表位模拟肽的多肽序列，ELISA鉴定噬菌体单克隆对HR4单抗的亲和力，测序获得1条多肽序列，命名为PT1，进一步鉴定噬菌体阳性克隆的靶向性结果提示噬菌体阳性克隆能够特异性结合人HR4单克隆抗体，筛选获得的人HR4单克隆抗体特异性多肽，进而构建HR4表位模拟肽疫苗，本发明HR4模拟表位为基础的疫苗，将会在临床的变应性鼻炎治疗，及HR4拮抗剂的研制方面打下良好的基础，为其构建工作提供初步的实验依据。<pb pnum="1" />
【IPC分类】A61P11/02, C07K7/08, A61P37/08, G01N33/577, A61K39/00
【公开号】CN105037499
【申请号】CN201510382781
【发明人】李琳, 李东原
【申请人】吉林大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月2日