酶溶液
[0044] 恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：AMV逆转录酶1U/ y 1，T7RNA聚合 酶5U/ y 1，核糖核酸酶H 0? 5U/ y 1，焦磷酸酶0? 5U/ y 1，RNA酶抑制剂5U/ y 1，BSA 0? 5 y g/ li lo
[0045] 3、装载有引物对和单链DNA探针的24反应腔碟式芯片
[0046] 所述24反应腔碟式芯片为博奥生物集团有限公司生产的"晶芯RTisochipTM-A恒 温扩增微流控芯片核酸分析仪"的配套碟式芯片，其型号为1X24,示意图如图1所示。
[0047] 所述24反应腔碟式芯片的1#至5#反应腔分别存放干燥的如下（1)_(5):
[0048] (1)引物对1和单链DNA探针1 ; (2)引物对2和单链DNA探针2 ; (3)引物对3和 单链DNA探针3; (4)内对照引物对和内对照探针；(5)阴性对照品。所述阴性对照品具体 为无RNA酶的水（Rnase-free水）。
[0049] 其中，所述引物对1(PIV1)用于扩增副流感病毒I型，由序列表中序列1和序列2 所示的两条单链DNA分子组成；所述引物对2 (PIV2)用于扩增副流感病毒II型，由序列表 中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成；所述引物对3 (PIV3)用于扩增副流感病 毒III型，由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成。所述内对照引物对 (GAPD_IC)用于扩增人基因组中管家基因GAPDH mRNA，由序列表中序列10和序列11所示 的两条单链DNA分子组成。
[0050] 所述单链DNA探针1 (PIV1_TY_MB)用于实时监测所述引物对1的扩增结果，其核 苷酸序列为序列表中序列7 ;所述单链DNA探针2 (PIV2TY MB)用于实时监测所述引物对2 的扩增结果，其核苷酸序列为序列表中序列8 ;所述单链DNA探针3 (PIV3_TY_MB)用于实时 监测所述引物对3的扩增结果，其核苷酸序列为序列表中序列9。所述内对照探针（GAPD_ IC_MB)用于实时监测所述内对照引物对（GAPD_IC)的扩增结果，其核苷酸序列为序列表中 序列12。每条所述单链DNA探针以及所述内对照探针（GAPD_IC_MB)的5'端均标记有荧光 报告基团FAM，3'端均标记有荧光淬灭基团TAMRA。
[0051] 其中，将引物和探针包埋入碟式芯片的方法为：将引物、与所述引物相对应的探 针、琼脂糖混合，配制成混合溶液，使所述引物、所述探针和所述琼脂糖在所述混合溶液中 的终浓度分别为0. 2 yM、50nM、0. 1% (质量百分含量）；取1 y 1所述混合溶液点入相应的 碟式芯片反应腔，于洁净超净台内晾干后，压片封装，冲压抽真空后制成。
[0052] 二、用于检测副流感病毒的试剂盒的使用方法
[0053] 1、反应体系配制
[0054]取15 y 1恒温扩增缓冲液（见步骤一 1)、10 y 1恒温扩增酶溶液（见步骤一 2)、 25 y 1待测样本液混合成50 y 1反应溶液，旋涡震荡均匀后注入装载有引物对和单链DNA探 针的24反应腔碟式芯片（见步骤一 3)，贴封口膜后迅速离心30s。
[0055] 2、恒温扩增反应与检测
[0056] 将碟式芯片置于博奥Isochip-RT恒温扩增仪中，设置41°C反应1小时，并同时完 成实时焚光扫描。
[0057] 3、结果判断
[0058] 反应结束后，根据各反应腔中样本的扩增曲线，按照如下方法确定所述待测样本 液中是否含有相应副流感病毒的基因组：若所述待测样品产生S型扩增曲线，则所述待测 样本液中含有相应副流感病毒的基因组；反之，则所述待测样本液中不含有相应副流感病 毒的基因组。
[0059]实施例2、用于检测副流感病毒的试剂盒的灵敏度和特异性分析
[0060] 一、参考品RNA核酸的制备
[0061]1、构建包含有副流感病毒靶标基因的质粒
[0062] (1)含有副流感病毒I型靶标基因的质粒
[0063] 将副流感病毒I型靶标基因序列的464~1296区段（副流感病毒I型靶标基因序 列的Genbank 号 Sequence ID:gb|jF416791. l|，Update Date :2014-12_31)插入到 pUC19 载体（天跟生化公司产品）的多克隆位点EcoR V间。得到重组质粒PUC19-PIV1。
[0064] (2)含有副流感病毒II型靶标基因的质粒
[0065] 将副流感病毒II型靶标基因序列的2568~3629区段（副流感病毒II型靶标基 因序列的Genbank号Sequence ID:gb|DQ072586. l|，Update Date :2008-9_4)插入到pUC19 载体（天跟生化公司产品）的多克隆位点EcoR V间。得到重组质粒pUC19-PIV2。
[0066] (3)含有副流感病毒III型靶标基因的质粒
[0067] 将副流感病毒III型靶标基因序列的211~1190区段（副流感病毒III型靶标 基因序列的 Genbank 号 Sequence ID:dbj |AB623488. 11，Update Date :2014-7_26)插入到 pUC19载体（天跟生化公司产品）的多克隆位点EcoR V间。得到重组质粒pUC19-PIV3。
[0068] 2、参考品RNA核酸的制备
[0069] 供试重组质粒：步骤1构建的3种含有相应副流感病毒靶标基因的重组质粒。 [0070] (1)酶切：先将各供试重组质粒使用EcoRI内切酶37°C酶切2h。
[0071](2)转录：按 5 y 1 5 X Transcription Optimized Buffer (Promega)，2U T7RNA 聚 合酶，lOmM DTT (Promega)，10U 重组 RNA 酶抑制剂（Promega)，2mM rNTP，酶切产物 5 y 1 配 制总体积为50 y 1的反应体系，震动均匀后37°C转录4h。
[0072]⑶消化：将转录完成后的体系加入1 y 1的DNA消化酶（rDnasel，5U/ y 1)，震荡 离心，37°C孵育20min。
[0073] (4)纯化：使用Macherey-Nagel公司的RNA纯化试剂盒产品（其产品目录号为 740948)按如下步骤纯化转录产物RNA :a)配制RA1-C2H50H混合液：以RA1: C2H50H = 1:1 (体 积比）的比例配制。每l〇〇yl的转录产物中，需要加入600 yl RA1-C2H50H混合液，即 300 y 1 RA1+300 y 1 C2H50H溶液，在这里需要根据转录产物的管数计算所配混合液的体积。 若产物不足1〇〇 y 1，则用水将产物的量补到1〇〇 y 1 (即在每管产物中加入50 y 1的天根 Rnase-free H20)。b)将之前准备好的RA1_C2H50H混合液分到1. 5ml离心管内，两管，每管 600 yl，将100 yl产物转入到相对应的离心管内，管内共700 yl，充分震荡离心。c)准备 两个吸附柱，并做好相应的标记，将700 y 1产物混合液转入到吸附柱内（吸附柱最大容量 为700 y 1)，1. 2万rpm离心2min，倒掉下层溶液。d)在吸附柱内加入700 y 1的RA3,放置 lmin，使其可以充分的分散在吸附柱的底部，1. 2万rpm离心2min，倒掉下层溶液。e)在吸 附柱内加入350 y 1的RA3,放置2min，1. 2万rpm离心2min，倒掉下层溶液。f)在吸附柱 内加入300 y 1的RA3,放置2min，1. 2万rpm离心2min，倒掉下层溶液。g)打开吸附柱的 盖子3min后，1.2万rpm空离2min，倒掉下层溶液，重复此步骤一次。h)空离结束以后，把 吸附柱转移到相对应的离心管中，打开吸附柱盖子放置15min，使乙醇挥发完全，在吸附柱 中加入60 y 1 Rnase_H20(试剂盒里自带的）洗脱，放置2min，1. 2万rpm离心2min。i)将 离心所得模板吸回吸附柱中，放置2min，1. 2万rpm离心2min，重复此步骤两次。j)丢掉吸 附柱，将离心管内的模板取出2 y 1，用Nano drop测定其浓度，并记录其浓度及其260/280， 260/230 比值。
[0074] 二、用于检测副流感病毒的试剂盒的灵敏度和特异性分析
[0075] 1、不同浓度的参考品模板制备
[0076] 将上述步骤一纯化后的各RNA模板（对应步骤一 1中构建的3种重组质粒）均计 算定量至101Q拷贝/ y 1，并梯度稀释，得到10 5拷贝/ y 1、104拷贝/ y 1、10 3拷贝/ y 1、102 拷贝/ y 1、10拷贝/ y 1等不同浓度的模板稀释液。
[0077] 2、反应体系配制
[0078]取15 y 1恒温扩增缓冲液（见实施例1步骤1)、10 y 1恒温扩增酶溶液（见实施 例1步骤2)、25 y 1某浓度的模板稀释液混合成50 y 1反应溶液，旋涡震荡均匀后注入装载 有引物对和单链DNA探针的24反应腔碟式芯片（见实施例1步骤3)，贴封口膜后迅速离心 30s〇
[0079] 3、恒温扩增反应与检测
[0080] 将碟式芯片置于博奥Isochip-RT恒温扩增仪中，设置41°C反应1小时，并同时完 成实时荧光扫描。并按照实施例1步骤二3的方法对结果进行判定。
[0081] 三、结果
[0082] 结果如图2所示：
[0083] (1)对于重组质粒PUC19-PIV1的RNA样品而言，24反应腔碟式芯片的1#反应腔 对1〇 5拷贝/ y 1、104拷贝/ y 1、103拷贝/ y 1、102拷贝/ y