[0027] 5、siRNA疗法开发-SRS和RSS面临的挑战
[0028]FabozziG等发现，除了病毒蛋白35(VP35)之外，VP30和VP40独立充当SRS，RNA 沉默的抑制因子（SRS)。他们已经证明了VP30和VP35的分子机制。仅在siRNA存在的情 况下，VP30和独立于siRNA的Dicer和一个Dicer伴侣（TRBP)相互作用。VP35以一种独立 于siRNA的方式，在对干扰素（IFN)不产生作用的情况下，直接和Dicer伴侣TRBP和PACT相互作用。结合这两点，他们的发现阐明了RNAi抑制的一种新机制，这就延伸到了SRS在 双链RNA(dsRNA)结合和IFN拮抗中所起作用之外。三个抑制因子的存在凸显了EBOV感染 中宿主RNAi依赖的抗病毒免疫的关联性，还阐明了RNAi在影响RNA病毒变异过程中的重 要性。
[0029]ZhuY.和其同事发现，埃博拉病毒（EB0V)VP35是一个毒力因子，能阻断先天的抗 病毒宿主反应，包括a干扰素的诱导和相关反应。VP35也是一个RNA沉默抑制因子 (RSS)。通过抑制微RNA指导的沉默（microRNA-directedsilencing)，哺乳动物病毒RSS 能够改变有益于病毒复制的细胞环境。一个包含特异性微RNA靶向序列的报告基因证明： 野生型VP35的优先表达可以阻断哺乳动物细胞的微RNA沉默。另外，野生型VP35C末端结 构域（CTD)的蛋白质融合物结合小干扰RNA(siRNA)。突变蛋白的分析表明，RSS试验中报 告基因的活性跟它们对抗双链RNA(dsRNA)活化的蛋白激酶R(PKR)或结合siRNA的能力并 没关联。结果表明，VP35存在的情况下，报告基因活性的增强代表着非特异性翻译的增强 和沉默的抑制。此外，哺乳动物细胞中特定的RSS活性绝大多数和RNA结合无关，与VP35 在隔离（sequester) -个或多个沉默复合蛋白中的作用一致。为了检验不含干扰素体系中 RSS的活性，他们还在充分表征的植物沉默抑制试验中测试了VP35。结果显示，VP35具有 很强的RSS活性，并且突变蛋白的活性跟RNA结合活性密切相关，但不限于仅跟RNA结合活 性密切相关。结果表明，在不能扩增dsRNA的哺乳动物体系中，VP35蛋白的相互作用在阻 断沉默中具有重要作用。
[0030] 6、siRNA疗法开发-导入障碍面临的挑战
[0031] 保护肺部免受外来颗粒物的影响有很多生物屏障和因素，如厚的弹性粘液层可能 结合吸入药物并通过黏液清除机制将药物清除，分化良好的气道上皮细胞表面的低基底和 刺激率，细胞内和细胞外的核糖核酸酶，以及靶细胞内的降解系统等。克服呼吸道导入和有 效地进入细胞发挥作用方面的难题会为siRNA作为系统EVD疗法铺平道路。此外，导入载 体和给药方式必须符合感染的阶段，并且在作用部位最快发生作用，如在成纤维细胞和内 皮细胞的早期感染阶段/预防阶段，疾病晚期通过全身给药。其中，通过静脉输入给药治疗 疾病最有效。在疾病大流行的背景下，静脉输入的给药方式能够更容易地对患者直接用药。 此外，埃博拉病毒能够感染血管内皮细胞，内皮细胞能够表达促进病毒进入细胞的特异性 受体，这两个发现将会促进血管内皮细胞直接导入抗病毒物质这种导入方式的开发，以控 制病毒引起的一些系统症状。
【发明内容】
[0032] 为克服现有技术中的上述问题，本发明提供了一种可抑制埃博拉病毒基因复制的 活性分子，及其在细胞和动物模型中检测沉默埃博拉病毒基因的分子活性的方法，以及作 为新型抑制埃博拉病毒复制的方法。
[0033] 本发明利用治疗性小干扰RNA(siRNA)制剂和导入系统来抑制埃博拉病毒的基因 表达，并治疗EVD患者。EVD患者感染埃博拉病毒后通常会有一个2-21天的潜伏期。这个 疾病的第1阶段没有什么特殊性，症状有极度乏力、腹泻、恶心和呕吐，伴厌食腹痛、头痛、 关节痛（关节神经痛）、肌痛、腰痛、口腔黏膜发红和吞咽困难。第二阶段的症状容易区分， 如出血、精神异常、无尿和打嗝。
[0034] 靶标选择
[0035] 埃博拉病毒属是丝状病毒科（filovirus)的一员。埃博拉病毒属有5种亚型：扎 伊尔埃博拉病毒（EB0V)、苏丹埃博拉病毒（SUDV)、塔伊森林埃博拉病毒（TAFV)、雷斯顿埃 博拉病毒（RESTV)和本迪布焦埃博拉病毒（BDBV)，其中EB0V、SUDV和BDBV造成了西非EVD 的大爆发。EB0V在圆柱形/管状的病毒颗粒中携带有负链RNA基因组，还包含病毒包膜、基 质和核衣壳组分。整个病毒颗粒圆柱体通常直径约80nm，并且在脂质双分子层表面黏附有 一个突出7-10nm的病毒编码的糖蛋白（GP)。圆柱体有不同的长度，通常是800nm，但有时 可长达lOOOnm。病毒颗粒外面的病毒包膜由宿主细胞膜出芽形成，在其生物形成过程中GP 就已插入其中。单个GP分子通常以10nm的间距出现。
[0036] 病毒蛋白VP40和VP24位于病毒包膜和核衣壳之间（如下），位于基质中。病毒颗 粒结构的中心是核衣壳，由一系列黏附于18_19kb线性负链RNA(没有3'-多聚腺甘酸或 5' -帽端（如下））的病毒蛋白组成；RNA螺旋缠绕在一起，并结合着NP、VP35、VP30和L蛋 白；这个RNA螺旋体直径为80nm，包含一个直径20-30nm的中心通道（图1)。纯化和可视 化之后（如分别通过离心和电子显微镜）病毒颗粒的整体形状有很大差别；简单的圆柱体 远不如反向的结构、分支和环（如U形、shepherd's crook、9形或eye bolt-shapes、或其 他形状或圆形/盘绕状）普遍，这可能源于实验室技术的应用。然而，"丝状"结构是丝状病 毒（GP修饰的病毒包膜，RNA核衣壳等）的一个更普遍的形态学特征。
[0037] 每个病毒颗粒都包含一个线性的单股负链RNA分子，含18959至18961个核苷酸， 没有3' -多聚腺甘酸和5' -帽端。此外，还发现来自3'末端的472个核苷酸和来自5' 末端的731个核苷酸足以让病毒复制。[9]埃博拉病毒颗粒编码7种结构蛋白和一个非结 构蛋白。基因排列顺序为 3' -头端（leader)-NP-VP35-VP40-GP/sGP-VP30-VP24-L-尾端 (trailer)-5' ；头端和尾端没有转录域，但携带控制转录、复制和将病毒基因组组装成新病 毒颗粒的重要信号。基因组本身不具有传染性，因为将病毒基因组转录为mRNA需要病毒蛋 白中RNA依赖的RNA聚合酶，由于其是负链RNA病毒，病毒基因组的复制也一样。在几组小 型哺乳动物的基因组中，来自丝状病毒的部分NP、VP35和L基因被确定是内源性的。
[0038] 因为是非细胞结构，像埃博拉这样的病毒不会通过任何形式的细胞分裂来复制； 相反，它们利用宿主和病毒编码的酶，沿着宿主细胞结构进行自我复制，产生多个拷贝；然 后，这些拷贝在宿主细胞中自组装成病毒大分子结构。当感染各个单独的细胞时，病毒要完 成一组步骤：病毒首先通过糖蛋白（GP)表面的病毒包膜颗粒与宿主受体结合发生攻击，并 在宿主细胞中内吞为微小的吞饮体（macropinosomes)。为了渗入细胞，病毒膜和囊泡膜融 合在一起，核衣壳释放到细胞质中。衣壳化的负链基因组ssRNA当做聚腺甘酸、单顺反子 mRNA和tRNA分子（利用宿主细胞核糖体）等合成（3' -5'）的模板，mRNA被翻译成单个的 病毒蛋白。
[0039] 这些病毒蛋白还要经过加工处理，糖蛋白前体（GP0)裂解为GP1和GP2,然后在细 胞酶和底物的作用下，GP1和GP2被高度糖基化。GP1和GP2首先组装成异质二聚体，然后 组装成三聚体，形成表面病毒包膜颗粒。分泌糖蛋白（sGP)前体裂解为sGP和delta多肽， 这两种物质都会被细胞释放。当病毒蛋白水平升高时，翻译转为复制。将负链基因组RNA 作为模板，来合成互补+ssRNA;之后所合成的互补+ssRNA作为合成新基因组（-)ssRNA的 模板，新合成的基因组（_)ssRNA很快壳体化。新形成的核壳体和包膜蛋白在宿主细胞的细 胞质膜进行组装；然后出芽，破坏细胞。
[0040] 如上所述，FabozziG等发现除了病毒蛋白35(VP35)之外，VP30和VP40也独立充 当RNA沉默抑制剂（SRS)。他们已经证明了VP30和VP35的分子机制。仅在siRNA存在的 情况下，VP30和独立于siRNA的Dicer和一个Dicer分子伴侣（TRBP)相互作用。VP35以 一种独立于siRNA的方式，在对干扰素（IFN)不产生作用的情况下，直接和Dicer伴侣TRBP 和PACT相互作用。结合这两点，他们的发现阐明了RNAi抑制的一种新机制，这就延伸到了 SRS在双链RNA(dsRNA)结合和IFN对抗中所起作用之外。三个抑制因子的存在凸显了EB0V 感染中宿主RNAi依赖的抗病毒免疫的关联性，还阐明了RNAi在影响RNA病毒变异过程中 的重要性。
[0041] 基于以上信息，我们决定选择埃博拉病毒的VP24、VP30、VP35、VP40和聚合酶L作 为siRNA鸡尾酒介导疗法的靶标。本发明提供了 17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸 长度的双链siRNA分子序列，所述的siRNA分子抑制埃博拉病毒VP24、VP30、VP35、VP40和 聚合酶L的表达。该siRNA分子两端为钝端（平末端），或在双链两侧的3'端悬挂有一个 或多个核苷酸。本发明所提供的siRNA鸡尾酒包含靶向埃博拉病毒VP24、VP30、VP35、VP40 和聚合酶L的两条、三条、四条或多条siRNA序列。通过靶向埃博拉病毒VP24、VP30、VP35、 VP40和聚合酶L，siRNA可诱导特定的病毒mRNA裂解。
[0042] 保守病毒基因组
[0043] 埃博拉病毒属是丝状病毒科（filovirus)的一员。埃博拉病毒属有5种亚型：扎 伊尔埃博拉病毒（EB0V)、苏丹埃博拉病毒（SUDV)、塔伊森林埃博拉病毒（TAFV)、雷斯顿埃 博拉病毒（RESTV)和本迪布焦埃博拉病毒（BDBV)，其中EB0V、SUDV和BDBV造成过西非EVD 的大爆发。本发明提供了靶向三种典型埃博拉病毒亚型EBOV、SUDV和BDBV保守区域的 siRNA分子，这三种亚型曾在非洲引起大规模EVD爆发。SUDV的完整基因组序列已经得到 阐述，如，GenbankAccessionNos.KC242783 ;AY729654 ;EU338380 ;FJ968794 和KC545389。 BDBV的完整基因组序列也已经得到阐述，如GenbankAccessionNos.KC545393 ;FJ217161 ; KC545396和KC545393。编码埃博拉病毒VP24、VP30、VP40和聚合酶L的三种亚型的保守区 域被选择用来作为siRNA分子序列。如表1所述，我们匹配（align) 了所有已公布的21条 病毒序列，然后设计了靶向五个所选基因的siRNA序列（表1)。
[0044] siRNA设计和序列筛选
[0045] 利用生物信息学程序，我们已经确定了 25mer的钝端siRNA，来干扰对埃博拉病毒 复制周期至关重要的关键基因域。这些关键基因包括VP24、VP30、VP35、VP40和聚合酶L基 因，但埃博拉病毒株的每一个基因都可以包含在这个列表中。siRNA预测软件确定给定长度 的siRNA(具有一个悬挂端的21个碱基（mer)的siRNA，或含25个碱基的钝端双链RNA)， 该siRNA和我们选择沉默的基因一致。
[0046] 软件能给出具有合适热力学性质的siRNA，去除已知的具有免疫刺激性的序列和 那些GC含量（35-65% )不适当的siRNA。满足我们最终标准的siRNA序列列表会输入到 一个文件中，并且保存在电脑硬盘中。另一个软件工具会打开siRNA列表文件，并按顺序检 查数据库中的每条siRNA序列，以确保所预测siRNA序列和病毒株基因序列的一致性。可 能需要做两个检索：1)siRNA序列和基因序列所有碱基精确一致；2)部分匹配-siRNA中的 特定碱基和所要匹配的基因序列不完全匹配。在第二种情况中，软件如果用大写字母（如CCATCGTTCCAAGGGTACGGCATAA)输出siRNA序列，意味着具有该序列的siRNA和靶基因中的 互补序列完全匹配，在这种情况下，匹配率将为100%。如果siRNA和所预测的基因序列不 一致，则碱基将会用小字母表示。例如，一个siRNA的序列和靶基因的互补序列完全匹配， 但是最后一个碱基不同，则表示为CCATCGTTCCAAGGGTACGGCATAa。众所周知，能高效沉默相 关基因的siRNA的最短有效长度为19个碱基的双链siRNA。这里给出的这个例子是所预测 的 25mer的siRNA。
[0047] 之前我们已经证明，在体外基因沉默中25mer的siRNA比19mer的siRNA更有效。 为了确保siRNA具有最佳热力学性质，头两个碱基应不含T或A，虽然这比siRNA的最后两 个碱基是T或A要好。原因就是，A和T使双链siRNA更容易解开并和Dicer中的反义链 配对。然而很多siRNA具有一致性的区域的末端可能会含有T和A，有时确定siRNA该区 域的绝对一致性是不可行的。因此，如果siRNA的末端区域的碱基不能精确配对，这可能有 助于提高siRNA的疗效。所以，我们筛选预测siRNA序列的算法为满足我们所有标准（整 个siRNA碱基序列的一致性，并且序列中的头两个碱基和末尾两个碱基是正确的碱基）的 siRNA提供了一个加权。根据如下公式对序列进行加权：[(预测siRNA长度-有效siRNA 的最小长度）* (连续的碱基配对数）V(碱基错配数+1)。如，在我们的示例中，25mer的 siRNA序列如下计算[(25-19) *(25)]/I= 150。
[0048]如果 25mer的siRNA的序列为CCATCGITCCAAGGGTACGGCATAA，若末端有 一个碱基配错了，值应该为[(25-19)*(24)]/2 = 72。若序列为CCATCGTTCCAAGGGTAC GTCATAA，值为[(25-19) *(19)]/2 = 57,因此，一个离末端较远的碱基配对出错的话会降 低值。此外，若序列为CCATCGTTCCAAGGGTACGTTCCGG，末端的六个碱基都配错的 话，值应为[(25-19)*(19)]/6) = 19。通过这个值可以估算如何排列感兴趣的抗病毒株的 siRNA。基于