病毒RNA，采用ZEB0V 糖蛋白特异性的正向（forward)、反向引物和TaqMan探针来进行RT-PCR分析。将病毒基 因表达水平的绝对定量（Absolutequantification)分析同阳性或阴性对照的绝对定量分 析进行比较。细胞中的RNA被提取出来，利用VP24、VP30、VP35、VP40和聚合酶LcDNA产 物的基因特异性的引物，进行5'-RACE分析。将PCR产物的长度和筛选出来的siRNA抑制 剂的有效性进行对比。筛选出具有高保护效率的单个siRNA或siRNA鸡尾酒，用于动物模 型研究。
[0129] 例16.豚鼠模型研究
[0130] 利用豚鼠模型来研究siRNA体内抑制埃博拉感染的疗效。用RGD-PEG-HKP三重纳 米颗粒体系壳体化的SiRNA鸡尾酒可进一步在动物模型中进行试验，如动物模型。通过腹 腔注射（ip)含siRNA鸡尾酒的纳米颗粒来治疗8只豚鼠，另外8只豚鼠用不含siRNA的三 重纳米颗粒来治疗，作为对照。给药3h后，在豚鼠皮下（sc)注射ZEB0V，豚鼠可能需要适 应ZEB0V。所有豚鼠都接受了三次追加（addition)的治疗，分别在注射ZEBOV24h、48h和 96h后。在进行实验的21天，仔细监测了所有豚鼠的疾病信号和生存状态。注射ZEBOV1 天、4天、7天和18天后收集血液，通过VeroE6细胞的菌斑试验来测定病毒滴度（virus titration)。来自治疗组和对照组的三只豚鼠分别在注射ZEBOV24h、72h和120h后实施安 乐死。对豚鼠实施安乐死之前，通过心脏穿刺收集全血，用于血液学计数和血清生化分析。 收集肾、肝、脾、胰腺和肺等器官并将其匀浆化，通过VeroE6细胞的噬菌斑试验来测定病毒 滴度。
[0131] 收集肾、肝、脾、胰腺、肺、胸腺、胃、小肠、结肠、颂下唾液腺、脑、子宫和下颂淋巴结 组织并固定（fixed)，用于组织病理学和免疫组织化学分析。
[0132] 例17?非人类灵长类动物研究
[0133] 非人类灵长类动物实验用来研究siRNA抑制剂抗埃博拉病毒感染中国猕猴的疗 效。研究在生物安全级别为4的实验室进行。SiRNA/RGD-PEG-HKP三重纳米颗粒体系是评 价siRNA药物活性的理想体系。
[0134] 第一组中，四只猕猴中的三只在接种ZEB0V30分钟之后，接受抗埃博拉病毒的 siRNA鸡尾酒治疗，对照动物用不含siRNA的三重纳米颗粒治疗。接受抗埃博拉的siRNA鸡 尾酒治疗的三只猕猴都接受了三次追加的治疗，分别在接种ZEBOV1天、3天和5天后，而对 照动物则用不含siRNA的三重纳米颗粒治疗。第二组中，动物每天都给予追加治疗，以探索 增加治疗的频率是否可以提高保护效果。四只猕猴中的三只在接种ZEB0V30分钟之后，接 受抗埃博拉的siRNA鸡尾酒治疗，然后接受了六次追加治疗，分别在接种ZEBOV1天、2天、 3天、4天、5天和6天后；而对照动物在相同的时间点用不含siRNA的三重纳米颗粒治疗。
[0135] 在整个研究过程中，用简单的单注射器注入栗静脉滴注生理盐水。在进行实验的 43天，仔细监测了所有动物的疾病信号和生存状态。接种ZEB0V3天、6天、10天、14天、22 天和40-43天后收集血液，利用VeroE6细胞的噬菌斑试验对收集到的猕猴血液样品进行 病毒滴度的测定。
[0136] 以下各表中列出了本申请中所涉及的核苷酸序列。
[0137] 表1列出了用于siRNA设计的埃博拉病毒基因组序列。其中，总共有21条埃博拉 病毒序列，代表了所有已公布的埃博病毒拉序列，排列出来用于设计靶向VP24、VP30、VP35、 VP40和LP基因的保守区域的siRNA。
[0138] 表 1
[0139]
[0140] 表2列出了抗埃博拉病毒蛋白24的siRNA。其中，含有钝端（x8)的25mersiRNA 或含有dtdt悬挂端（x8)的21mersiRNA，靶向埃博拉病毒序列中VP24基因的保守区域。
[0141] 表 2
[0142]
[0143] 表3列出了抗埃博拉病毒蛋白30的siRNA。其中，含有钝端（x8)的25mersiRNA 或含有dtdt悬挂端（x8)的21mersiRNA，靶向埃博拉病毒序列中VP30基因的保守区域。
[0144] 表 3
[0145]
[0146] 表4列出了抗埃博拉病毒蛋白35的siRNA。其中，含有钝端（x8)的25mersiRNA 或含有dtdt悬挂端（x8)的21mersiRNA，靶向埃博拉病毒序列中VP35基因的保守区域。
[0147] 表 4
[0148]
[0149] 表5列出了抗埃博拉病毒蛋白40的siRNA。其中，含有钝端（x8)的25mersiRNA 或含有dtdt悬挂端（x8)的21mersiRNA，靶向埃博拉病毒序列中VP40基因的保守区域。
[0150] 表 5
[0151]
[0152] 表6列出了抗埃博拉病毒L蛋白的siRNA。其中，含有钝端（x8)的25mersiRNA 或含有dtdt悬挂端（x8)的21mersiRNA，革El向埃博拉病毒序列中L聚合酶基因的保守区 域。
[0153] 表 6
[0154]
[0155] 表7列出了已经被证明有效的针对Zaire埃博拉病毒的小干扰核苷酸siRNA序 列，siRNA双链具有强大的（potent)抗埃博拉病毒活性。其中，革E1向扎伊尔埃博拉病毒的 siRNA序列已经在细胞培养模型中进行测试，以检测其抗病毒活性。正链（positive)siRNA 可用来作为体外筛选试验的阳性对照。
[0156] 表 7
[0157]
[0158] 表8列出了用于病毒RNA水平RT-PCR分析的DNA引物。其中设计和筛选用于 RT-PCR分析的引物，以检测病毒序列和测定病毒感染细胞经过治疗后病毒基因的表达水 平。
[0159] 表 8
[0160]
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