AGC-3' 和ActinR: 5<-ggcTGGAAGAGGACCTCAGG-3'。实时定时PCR扩增条件为：2 min / 95°C ; 40 cycles (20 sec / 95°C , 30 sec / 59°C , 30 sec / 68°C )〇
[0017] 2. 2. 5GUS融合表达载体构建 为研究化化W基因时空表达特异性，用化基因特异引物扩增化基因启动 子，所用引物序列为：PCR反应体系如下： FBHGUSF:5> -CCGCTGCAGCTTTGTTACCACAATATTM-3' 和FBHGUSR:5, -ATAGAATTCGGCCGCCCACACAACCTCAA-3,。
[0018] 扩增的PCR产物回收后用用相应的酶切位点和PCAMBIA1391Z空载体进行连接，然 后转化大肠杆菌，通过酶切鉴定和PCR鉴定后，阳性克隆进行测序分析，确保无碱基突变后 将导入农杆菌中转化水稻，产生转基因植株。扩增条件为1min/ 95°C;30cycles(30 sec/ 94°C，30sec/ 57°C，2min/ 72°C) ; 5min/ 72°C。
[0019] 2. 2. 6GUS染色 (1)取检测正确的GUS报告转基因植株的幼苗极其根、叶、分生组织化及成熟的根、茎、 叶、不同时期的穗、花器官等组织放入GUS染液中；于25-37°C保溫1小时至过夜。
[0020] (2)叶片等绿色材料转入70%乙醇中脱色2-3次，到阴性对照呈白色。
[002。 （3)肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点。
[0022] 2. 2. 7GFP融合载体构建 cDAN从15天大小的水稻幼苗中通过RT-PCR方法获得，设计一对引物扩增化 基因0RF序列（去除终止密码子序列），使基因的0RF与载体的GFP处于同一阅读框，在 引物设计中引入況?al和&7I两个酶切位点用于与载体中相应酶切位点连接。用于扩 增的引物序列为：FBHGFPF: 5 ' -TTACCCGGGGAGAGGAGAGAAGGGGATGT-3 ' 和FBHGFPR: 5 ' -GAGGTCGACGCCAGAGTACTGCTGATGCT-3'。扩增的PCR产物用況?al和&刀双酶切后连接到用 相同酶酶切的P35S-GFP载体上，连接后转化大肠杆菌，通过酶切鉴定和PCR鉴定后，阳性克 隆进行测序分析，确保无碱基突变。测序正确的载体进行瞬时表达。PCR扩增条件为30sec / 98°C; 35cycles(10sec/ 98°C, 15sec/ 63°C, 90sec/ 72。〇; 5min/ 72°C。 [002引 3.结果 3.1过表达转基因植株的获得及检测 水稻种子的成熟胚通过诱导产生愈伤组织，经继代培养后，能够分裂出更多组织细胞， 将之前已经构建好的过表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化，浸染愈伤组织中，再用含有 筛选标记基因相应抗生素的培养基中进行筛选，28天后，将筛选获得的长势良好的愈伤移 入分化培养基中，长出绿点并成苗后再将长势良好的幼苗切除根部后移入生根培养基，等 培养至大量根产生。即可将幼苗移入大田种植（图1A-D)。
[0024] 为了验证转基因植株化巧?似是否转化成功，我们从田间收集单株叶片，利用CTAB 法提取转基因植株基因组DNA，W野生型日本晴和d地2〇做阴性对照，重组质粒做阳性对照， 用标记基因妊"7对转基因植株进行PCR分子检测，其中成功转化的转基因植株可W扩增出 和重组质粒相同大小的目的条带，阴性对照不能扩出目的条带（图1E)。统计检测结果表明： 10个独立株系118株过表达转基因植株中，92株为转基因阳性植株，阳性率为78%(图1E)。 [00巧]3. 2化过表达转基因植株的表型分析 我们对过表达转基因植株的表达进行了检测，结果表明，其中1-6号植株目的基因的 表达量均有不同程度的上升，2号植株过量表达程度最高，7、8号植株目的基因表达与野生 型没有明显差异（图2A)，表明过表达载体正常工作。同时，我们对田间过表达植株的表型 进行了观察和分析，结果表明，与野生型相比，过表达转基因植株表现为晚抽穗，分葉多（图 2B)。研究表明过表达化巧?似延迟了水稻的抽穗日期，增加水稻的分葉。
[0026] 3. 3 0/巧似组织特异性表达分析 为了掲示0/巧似基因的表达模式，我们构建了目的基因与GUS融合表达载体。将构建 好的重组载体P化巧化利用农杆菌介导的转基因方法转入野生型水稻日本晴获得转 基因植株。收集转基因植株的根、茎、叶、叶銷、分生组织、不同时期的穗，将组织用GUS染液 进行染色，经酒精脱色后，肉眼或显微镜观察染色部位。结果表明，目的基因在水稻的根、 茎、愈伤组织、叶、叶銷、茎顶端分生组织、居间分生组织及不同时期的幼穗中都有表达（图 3A-M)，在叶片及居间分生组织表达量较高（图3E、M及H，I，J中箭头所示)。花器官中主要 在有绿色部分的内外釋中表达，而在帷雄蕊中检测不到表达（图3G，K，L中箭头所示)。对于 整个幼苗，在叶片中有较高表达，但在根中表达较低（图3M)。为了探索目的基因在叶片组织 细胞中的表达，我们将叶片横切，制成石蜡切片，放入显微镜下观察。结果表明，目的基因主 要在叶肉细胞中表达（图3N，0中箭头所示)。综上所述，目的基因化主要在叶片中表 达，运一点与光周期相关基因的表达吻合。
[0027] 为了进一步验证GUS染色的结果，我们用realtime-PCR分析目的基因化在 不同组织器官中的表达。收集的根、茎、叶、叶銷和不同时期幼穗，提取总RNA，反转录后进行 实时定量PCR分析，结果表明化/顶W基因在不同组织中均有表达，但是，在叶片中表达量最 高，而茎、茎顶端分生组织和幼穗表达较低（图3P)。运一结果同之前的GUS染色结果相符。 证明该目的基因的确主要在叶片中表达。
[0028] 3. 4化亚细胞定位 为了探索化的亚细胞定位，我们构建了化与GFP融合载体，将构建好的GFP融合载体P化/顶W/ 巧转入农杆菌EHA105,将含有融合载体的农杆菌注射到烟草叶片中 进行瞬时表达，并用空载体PCAMBIA35S-GFP作为对照；2-3d后再用DAPI染色，将染色完成 的载玻片放入激光共聚焦显微镜下成像。结果显示：作为对照的空载体没有特异性表达，在 细胞中均有表达（图4D-F)，而目的基因化细胞核中特异表达（图4A-C);运一结果说 明，转录因子化/双w是一个核定位蛋白。
[0029] 本发明还利用基因枪将融合载体P化做做/.?做7导入洋葱细胞中进行瞬时表达， 并W空载体PCAMBIA35S-GFP作为对照；24h后放入激光共聚焦显微镜下成像。结果同烟草 细胞瞬时相同：作为对照的空载体没有特异性表达，在细胞中均有表达（图4J-L)，而目的 基因化/顶W融合信号在细胞核中特异表达（图4G-I);运一结果说明，化/顶W定位于细胞 核中，是一个核定位蛋白。
【主权项】
1. OsFBHl转录因子的核苷酸序列，其特征在于OsFBHl基因的核苷酸序列为SEQID No. 1所示，OsFBHl编码一个399个氨基酸的蛋白质序列为SEQIDNo2所示。2. 权利要求1所述OsFBHl转录因子核苷酸序列的mRNA序列为SEQIDNo. 3所示。3. 权利要求1或2所述OsFBHl转录因子的核苷酸序列在制备调控水稻抽穗期、提高水 稻产量方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种OsFBH1转录因子在调控抽穗期方面的应用。其中OsFBH1转录因子的核苷酸序列，为SEQ？ID？No.1所示，OsFBH1编码一个399个氨基酸的蛋白质序列为SEQ？ID？No？2所示。本发明利用反向遗传学方法对水稻<i>OsFBH1</i>的功能进行了研究，结果表明<i>OsFBH1</i>定位于细胞核中，是一个核蛋白，主要在叶片中大量表达，可以调控水稻的抽穗期早晚。水稻抽穗开花期是水稻产量的重要构成要素之一，对水稻产量有重要影响；同时水稻抽穗开花的早晚常伴随着水稻籽粒产量的变化，因此清晰的揭示水稻成花的分子调控通路，利用分子设计辅助育种，对于提高水稻产量具有广阔的应用前景。
【IPC分类】C12N15/29, A01H5/00, C12N15/11, C07K14/415
【公开号】CN105200064
【申请号】CN201510551293
【发明人】栾维江, 孙琼琳
【申请人】天津师范大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月2日