种被标记时，单个核苷酸标记物发射引起的时间依赖性 信号被转换为对应标记的核苷酸在核酸序列中的位置的序列。随后，对不同样品中的四种 核苷酸的每一种重复该过程，并且四个部分的序列随后被比对以组装完整的核酸序列。
[0069] 当分析多色标记的核酸（DNA)序列时，从一种或更多种供体标记物到可存在于核 酸分子上的四种不同的受体标记物的每一种的能量转移可产生四种不同的波长或颜色的 光发射（每一种与四种核苷酸中的一种相关），其允许直接的序列读出。
[0070] 務位谏度
[0071] 与基于纳米孔的测序方法相关的主要障碍是核酸穿过纳米孔的高移位速 度（约500. 000-1.000. 000核苷酸/sec)，由于记录装置的受限的带宽，其不允许直接 的序列读出。用两种不同的纳米孔蛋白减慢核酸移位的方法近来由Cherf等人（Nat Biotechnol.2012Feb14;30(4):344_8)和Manrao等人（NatBiotechnol.2012Mar25; 30(4):349-53)显示并通过引用被并入本文。两个研究组都使用DNA聚合酶从靶模板合成 互补链，其导致模板DNA穿过纳米孔的逐步移位。因此，核酸聚合酶的合成速度（10-500核 苷酸/sec)决定了DNA的移位速度，并且由于其比直接核酸移位慢大约3-4个数量级，单核 苷酸的分析变得可行。然而，聚合酶辅助的移位需要大量的样品制备以产生用于聚合酶的 结合位点，并且大批的核酸合成必须被阻断并且只能在核酸-聚合酶复合物被纳米孔蛋白 质捕捉后才能开始。这导致相当复杂的设置，其可能阻止其在商业环境中的实施。此外，聚 合酶合成反应中的波动诸如停滞的聚合作用（stalledpolymerization)以及聚合酶从核 酸上的解离可妨碍序列读出，分别导致高错误率和减小的读段长度。如本申请描述的光学 纳米孔测序使用不同的减慢DNA移位的方式。靶核酸通过掺入荧光修饰的核苷酸被酶促地 复制。所得的标记的核酸具有增加的标称直径，其导致当被牵拉穿过纳米孔时减小的移位 速度。用于光学测序的优选的移位速率处于每秒钟1-1000个核苷酸的范围内，并且更优选 的范围是每秒钟200-800个核苷酸，并且最优选的移位速率是每秒钟200-600个核苷酸。
[0072] 可选地，多核苷酸特别是单链多核苷酸的移位速度可通过以下来控制：采用被定 制尺寸的纳米孔以便附接至底部的加合物和/或标记物例如有机染料抑制但不阻止多核 苷酸的移位。移位速度可通过以预定的密度附接标记物和/或加合物被选择。此类标记物 和/或加合物可具有规则间隔的附接，例如，每三个核苷酸等的附接，或它们可以具有随机 性、或伪随机性（pseudorandom)附接，例如，每个C可以被标记。在一些实施方案中，选定数 目的不同核苷酸可以被标记，例如，每个A和C，或每个A和G，或每个A和T，或每个C，等， 其导致平均移位速度。可以通过将加合物附接至未标记的核苷酸来减小此平均速度。加合 物包括可使用常规化学反应附接至核苷酸的任何分子，通常为有机分子。通常加合物具有 与常见有机染料例如，荧光素，Cy3等相同范围内的分子量。加合物可以或可以不能够产生 信号，即，充当标记物。在一些实施方案中，加合物和/或标记物被附接至核苷酸的碱基上。 在其他实施方案中，标记物和/或加合物可附接至多核苷酸中的核苷之间的连键。在一方 面，控制单链多核苷酸穿过纳米孔的移位速度的方法包括将加合物以一定密度附接至多核 苷酸的步骤，其中由于附接的大量加合物或由于附接的加合物的密度，单链多核苷酸的移 位速度单调减小。在一些实施方案中，并不是多核苷酸的每一种核苷酸都被标记。例如， 可以产生多核苷酸的四种不同的组，其中每一组的核苷酸被相同的分子例如荧光有机染料 受体标记，但是在每一组中不同种类的核苷酸将被标记。因此，在组1中仅A可被标记；在 组2中仅C可被标记；在组3中仅G可被标记；等等。在这样的标记之后，四组多核苷酸随 后可以根据本文描述的方法和系统分别分析，并且多核苷酸的核苷酸序列从四个分析产生 的数据确定。在此类实施方案和类似的实施方案中，使用了例如两种标记物，其中多核苷酸 的一些核苷酸没有被标记，穿过纳米孔的移位速度将受到标记物沿着多核苷酸的分布的影 响。为了防止移位速度中这样的变化性，在一些实施方案中，没有被受体或供体标记用于产 生信号以确定核苷酸序列的核苷酸可通过附接非产生信号的加合物被修饰，所述非产生信 号的加合物具有与产生信号的标记物基本上相同的对移位速度的影响。 实施例
[0073] 在该实施例中，描述了用于确定多核苷酸的受体标记的核苷酸的序列的纳米孔装 置，之后其被用于检测第一多核苷酸中受体标记的胞嘧啶的序列并且检测第一受体标记的 胸腺嘧啶或胸苷的序列和第二多核苷酸中第二受体标记的胞嘧啶。
[0074]MM钻孔以在氮化硅膜中形成纳米孔：在钻孔过程之前用氧等离子体清洁具有 50X50um蚀刻的窗口的被30nmSi3N4膜跨越的3mm的Si芯片（Protochips，NC)。将清洁 过的芯片插入氦离子显微镜（Orion，Zeiss)的真空室中。插入后，通过具有~5pA的束流 的聚焦离子流穿过20μm的孔眼并以被校准以导致4+/-2nm的孔洞的暴露时间来钻入纳米 孔洞。
[0075] 蛋白质纳米孔：使用野生型α溶血素蛋白的克隆的变体作为模板用于体外转录 /翻译反应。所得单体通过逐步添加脱氧胆酸钠至终浓度6. 25mM并且随后在4°C持续孵 育12小时被七聚化。使用异双功能交联剂（SMCC，磺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基）环己 烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯）将所得七聚物与胺修饰的寡核苷酸附接。此寡核苷酸充当3kb ds-DNA片段的杂交位点，该3kbds-DNA片段被用作将蛋白质纳米孔牵拉进Si3N4膜中的钻 出的孔洞中的拖拽力。除了寡核苷酸修饰，蛋白质纳米孔的底部也被一个或多个马来酰亚 胺活化的荧光染料修饰。附接的荧光团可以作为FRET反应中的供体或受体。
[0076] 杂合纳米孔：将具有钻出孔洞的TEM网格通过浸没在90°C的热Piranha溶液（3 :1 硫酸：H202,v/v)中持续15分钟或通过空气等离子持续5分钟来清洁。在用水彻底地冲洗 后，TEM网格被安装在分隔顺式和反式的室的Delrin固定器（holder)上。反式室被盖玻 片封闭，其允许纳米孔的光学询问。每一个室被填充乙醇以促进纳米孔的湿润。乙醇随后 被水替换并且之后被缓冲的1MKC1溶液替换。在反式室中缓冲的KC1含有50%甘油以辅 助TIR(全内反射）成像。顺式室和反式室两者内含有与缓冲溶液接触的Ag/AgCl电极，阴 极⑴在顺式室中并且阳极㈠在反式室中。将纳米孔蛋白质添加至SiN膜的顺式侧并且 通过应用电场（200mV至600mV)，蛋白质纳米孔被塞入钻出的纳米孔洞，形成杂合纳米孔。
[0077] 在600mV5分钟至25分钟后，通常50%至75%的钻出的孔洞中具有插入的蛋白 质纳米孔。在装备有AP0N60XTIRF油浸物镜和用于激发附接在蛋白质纳米孔的荧光团的 532nm二极管激光器的倒置显微镜（Olympus1X71)上检查杂合纳米孔的形成。更换顺式室 中的缓冲液以去除过量的纳米孔蛋白质。将被标记的单链（ss)DNA以终浓度10nM添加至 顺式室中。电场降低至200mV至400mV，这促进单链DNA移位穿过杂合纳米孔。当离开纳米 孔时，标记的DNA与激发的供体荧光团紧密毗邻。发生FRET反应，导致光子从标记的DNA 发射。发射的光子被收集，过滤并且使用〇rcaFlash4.OcMOS相机（Hamamatsu)以500Hz 至5000Hz的帧速成像。使用ImageJ从原始的tiff图像中覆盖整个杂合纳米孔的5X5 像素区域中提取数据。将原始记录（rawtraces)标准化，并且使用寻峰算法（peakfind algorithm)鉴定FRET信号。在鉴定的峰值上进行碱基识别（basecalling)。
[0078] 以下107-mer的单链多核苷酸（SEQIDNO:1)的每一个胞嘧啶被Cy5荧光团标 记。
[0079] 3 ' -AACGGCCCTTCGATCTCATTGAGGATGAGAGGAGAGTCAAAGGAAGA-ACGAGGATGAGAGGAGAG TGAGAGCAAAGGAAGAACGAGGATGAGAGG-AGAGTGAGAGCAAAGGAAGAA-5,
[0080] 将被标记的多核苷酸以3'为先的方向移位穿过杂合纳米孔并且收集来自被标记 的胞嘧啶的混合的FRET信号。原始数据示于图1B中。当移位穿过杂合纳米孔时，观察到 对应于DNA中胞嘧啶的数目的多个峰。显著地，位于3'端的同聚物被完美地分辨。
[0081] 在5'端的第20个核苷酸位置后，以下单链多核苷酸（SEQIDNO:2)的每一个胞 嘧啶和每一个胸腺嘧啶分别被Cy5和Atto700标记。
[0082] 5 ' -GCTATGTGGCGCGGTATTATTAAGAAGGAGACTGAGAGGAGAGAA-GGAGCAAGAAGGAAATGAGA GCGAGAGGAGAGAAGGAGGAAGAAG-3?
[0083] 被标记的多核苷酸以3'为先的方向移位穿过杂合纳米孔并且收集来自被标记的 胞嘧啶和胸腺嘧啶的混合的FRET信号。原始数据示于图1D中。此原始数据记录的峰值显 示出类似于模板链中被标记的核苷酸的位置的型式（pattern)。
[0084] 本公开内容并不意图限制于所列具体形式的范围，而是意图覆盖本文描述的变化 形式的替代、修改和等价物。此外，本公开内容的范围充分涵盖鉴于此公开内容而对本领域 技术人员来说变得明显的其他变化。本发明的范围仅受所附的权利要求限制。
[0085] 定义
[0086] "纳米孔"意指位于基质中的任何开口，其允许分析物以预定的或可辨别的顺序穿 过基质，或在聚合物分析物的情况下，允许聚合物的单体单元以预定的或可辨别的顺序穿 过基质。在后一种情况下，预定的或可辨别的顺序可以是聚合物中单体单元的一级序列。 纳米孔的实例包括蛋白质性质的或基于蛋白质的纳米孔、合成的或固态的纳米孔、和包括 其中嵌入蛋白质纳米孔的固态纳米孔的杂合纳米孔。纳米孔可以具有例如，lnm至10nm或 lnm至5nm或lnm至3nm或其他各种大小的内径。蛋白质纳米孔的实例包括但不局限于， α溶血素、电压依赖性线粒体孔蛋白（VDAC)、OmpF、OmpC、MspA和LamB(麦芽糖孔蛋白）， 例如，公开于Rhee，M.等人，TrendsinBiotechnology，25 (4) (2007) :174-18;Bayley等 人（以上引用）；Gundlach等人，美国专利公布2012/0055792等等，通过引用将其并入本 文。可以采用允许单个氨基酸分子的移位的任何蛋白孔。纳米孔蛋白质可以在孔的外部的 特定的位点被标记，或在组成孔形成蛋白的一个或更多个单体单元的外部的特定位点被标 记。孔蛋白选自诸如但不局限于以下的蛋白质的组溶血素、MspA、电压依赖性线粒体孔 蛋白（VDAC)、炭疽孔蛋白、0mpF、0mpC和LamB(麦芽糖孔蛋白）。将孔蛋白整合至固态孔洞 是通过将带电荷的聚合物附接至孔蛋白来完成的。在施加电场后，带电荷的复合物被以电 泳方式牵拉入固态孔洞。合成的纳米孔或固态纳米孔，可以被以被创建在各种形式的固态 基质中，固态基质的实例包括但不局限于硅酮（例如，Si3N4,Si02)、金属、金属氧化物（例 如，A1203)、塑料、玻璃、半导体材料和其组合。合成的纳米孔可以比置于脂双层膜中的生物 蛋白孔更稳定。合成的纳米孔还可以通过使用嵌入在合适的基质中的碳纳米管来创建，所 述合适的基质诸如但不局限于聚合的环氧树脂。碳纳米管可以具有均一的并且定义明确的 化学性质和结构性质。可以获得各种大小的碳纳米管，范围从一至几百纳米。碳纳米管的 表面电荷已知约是零，并且作为结果，核酸穿过纳米孔的电泳运输变得简单和可预测（Ito， T.，Chem.Commun. 12 (2003) : 1482-83)。合成的纳米孔的基质表面可以被化学修饰以允许蛋 白质孔的共价附接或以致使表面性质合适于光学纳米孔测序。此类表面修饰可以是共价的 或非共价的。大多数共价修饰包括有机硅烷沉积，其最常用的方案被描述为：1)从水性乙 醇中沉积。这是制备甲烷硅基化表面的最简易的方法。95%乙醇-5%水的溶液用乙酸调 整至pH4. 5至pH5. 5。将硅烷伴随搅拌添加至产生2%的终浓度。在水解作用和硅醇基 团形成之后将基质添加持续2-5分钟。通过短暂地浸渍在乙醇中将游离的过量材料冲洗之 后。在110摄氏度持续5至10分钟使硅烷层硬化。2)气