. 5KV，电阻600 Ω，电容25 μ F(电击杯宽度为2_)。在含25mg/L的卡那霉素 LB平板 上筛选获得重组菌株，分别命名为C. glutamicum/pEC-dhaT-pdu和C. glutamicum Δ IdhA/ pEC-dhaT-pdu〇
[0038] 实施例4
[0039] 重组谷氨酸棒杆菌 C. glutamicum/pEC-dhaT-pdu 和 C. glutamicum Δ IdhA/ pEC-dhaT-pdu的发酵培养。
[0040] 谷氨酸棒杆菌菌株 C. glutamicum/pEC-dhaT-pdu 和 C. glutamicum Δ IdhA/ pEC-dhaT-pdu在含有25mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养。从该新鲜平板上单菌落接种 到含有30ml种子培养基的250ml带档板摇瓶中，32°C，200rpm培养12小时。
[0041] 种子培养基的配方包括（g/L):葡萄糖 25、（NH4)2S045 . 0、K2HPO4 L 5、MgSO4 L 0、 MnSO4 0.005、FeSO4 0.005、玉米浆 30、卡那霉素 0.025。
[0042] 以10%的接种量将种子液接种到2L发酵培养基当中，发酵采用5L的发酵罐，控制 温度为32°C，通气量为lvvm，调整转速使得溶氧水平保持在10%以上，通过流加氨水控制 pH值稳定在7.0左右。
[0043] 发酵培养基配方包括（g/L):葡萄糖 50,甘油 15,（NH4)2SO4 3. 0、K2HP04 L 5、MgSO4 1. 0、MnSO4 0.0 KKFeSO4 0. 010、玉米浆15、卡那霉素0. 025、盐酸硫胺素0. 005、维生素 B12 0. 005〇
[0044] 发酵72小时结束谷氨酸棒杆菌菌株C. glutamicum /pEC-dhaT-pdu的OD600达 到11，谷氨酸产量达到14. 0g/L，1，3-丙二醇产量达到8. 2g/L，乳酸产量为2. 3g/L，没有丁 二酉享，丁二酸等副产物的产生。谷氨酸棒杆菌菌株C. glutamicum Δ ldhA/pEC-dhaT-pdu的 〇D_达到12,谷氨酸产量达到15. 7g/L，1，3-丙二醇产量达到11. 7g/L，没有乳酸，丁二醇， 丁二酸等副产物的产生。1，3-丙二醇对甘油的质量转化率达到78%，接近理论转化率。说 明在谷氨酸棒杆菌里引入1，2_丙二醇脱水酶及其激活因子以及1，3_丙二醇脱氢酶可以实 现谷氨酸和1，3-丙二醇的联产。敲除IdhA基因有利于进一步提高谷氨酸和1，3-丙二醇 的产量。
[0045] 实施例5
[0046] 过表达甘油脱水酶及其激活因子以及1，3_丙二醇脱氢酶基因的重组质粒 pEC-dhaT-dhaB 构建。
[0047] 以克雷伯氏肺炎杆菌HR526的基因组为模板，以引物dhaB-F(CCGCtaaAAGGAGATA TACCatgAAAAGATCAAAACGATTTGCAGTACTGG)和 dhaB-R(CGCATGCTTACCCCCTGTTATTAGCTTCCT TTACGCAGCTTATGCCGC)为引物进行PCR，获得甘油脱水酶dhaB123基因（如SEQ ID NO. 3 所示）并进行PCR产物纯化（天根生物PCR产物纯化试剂盒）。以质粒pEC-dhaT-pdu为 模板，以引物 pEC-F (GGTATATCTCCTTttaGCGGGCGG)和 pEC-R(TAACAGGGGGTAAGCATGCGCT) 为引物进行PCR，获得质粒骨架pEC-dhaT片段并进行纯化（天根生物PCR产物纯化试剂 盒）。将pEC-dhaT片段和dhaB123用GibsonAssembly -步连接获得的重组质粒，命名为 pEC-dhaT-dhaB.。
[0048] 实施例6
[0049] 表达甘油脱水酶及其激活因子以及1，3-丙二醇脱氢酶基因的重组谷氨酸棒杆菌 的构建。
[0050] 利用电穿孔仪（伯乐）将pEC-dhaT-dhaB通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌重组菌 C. glutamicum Δ IdhA中，电击条件为电压2. 5KV，电阻600 Ω，电容25 yF(电击杯宽度为 2mm)。在含25mg/L的卡那霉素 LB平板上筛选获得重组菌株，命名为C. glutamicum Δ IdhA/ pEC-dhaT-dhaB D
[0051] 实施例7
[0052] 重组谷氛酸棒杆菌C. glutamicum Δ ldhA/pEC-dhaT-dhaB的发酵培养。
[0053] 谷氛酸棒杆菌菌株 C. glutamicum Δ ldhA/pEC-dhaT-dhaB 在含有 25mg/L 卡那霉 素的LB平板上过夜培养。从该新鲜平板上单菌落接种到含有30ml种子培养基的250ml带 档板摇瓶中，32°C，200rpm培养12小时。
[0054] 种子培养基的配方包括（g/L):葡萄糖 25、（NH4)2SO4 5. (KK2HPO4 1.5、MgSO4 1.0、 MnSO4 0.005、FeSO4 0.005、玉米浆 30、卡那霉素 0.025。
[0055] 以10%的接种量将种子液接种到2L发酵培养基当中，发酵采用5L的发酵罐，控制 温度为32°C，通气量为lvvm，调整转速使得溶氧水平保持在10%以上，通过流加氨水控制 pH值稳定在7.0左右。
[0056] 发酵培养基配方包括（g/L):葡萄糖 50、甘油 15、（NH4)2SO4 3. 0、K2HP04 I. 5、MgS04 1. 0、MnSO4 0. 010、FeSO4 0. 010、玉米浆15、卡那霉素0. 025、盐酸硫胺素0. 005、维生素 B120.005〇
[0057] 发酵72小时结束。谷氛酸棒杆菌菌株C. glutamicumA ldhA/pEC-dhaT-dhaB的 〇D_达到12,谷氨酸产量达到14.2g/L，l，3-丙二醇产量达到11.4g/L，没有乳酸，丁二醇， 丁二酸等副产物的产生。说明在谷氨酸棒杆菌里引入甘油脱水酶及其激活因子以及1， 3_丙二醇脱氢酶同样可以实现谷氨酸和1，3-丙二醇的联产。
[0058] 实施例8
[0059] 产品的分离纯化。
[0060] 利用实施例4的方法获得C. glutamicum Δ ldhA/pEC-dhaT-pdu发酵液2L。发酵液 经微滤膜过滤获得菌体和滤液（滤膜截留分子量为300MW，过滤温度为40°C)。菌体可以直 接干燥，用做饲料添加剂。滤液用硫酸调节PH值至谷氨酸等电点，待谷氨酸等电析出后经 过过滤获得谷氨酸和第二处理液，谷氨酸纯度为95%以上，得率为80%以上。第二处理液 经过浓缩、精馏分离获得1，3-丙二醇。1，3-丙二醇的纯度在99%以上，收率在70%以上。
[0061] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵联产1，3-丙二醇和谷氨酸的方法，其特征在于，包 括通过以下步骤获得重组谷氨酸棒杆菌： 1) 在谷氨酸棒杆菌中引入1，3_丙二醇脱氢酶的编码基因； 2) 在谷氨酸棒杆菌中引入1，2_丙二醇脱水酶及其激活因子的编码基因或者引入甘油 脱水酶及其激活因子的编码基因。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括敲除谷氨酸棒杆菌的内 源ldhA基因。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因 如SEQIDNO. 1所示，所述1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子的编码基因如SEQIDNO. 2所 示，所述甘油脱水酶及其激活因子的编码基因如SEQIDNO. 3所示。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括构建含有1，3-丙二醇 脱氢酶的编码基因和1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子的编码基因的重组质粒，或者，构建 含有1，3_丙二醇脱氢酶的编码基因和甘油脱水酶及其激活因子的编码基因的重组质粒。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述重组质粒还含有lac启动子。6. 根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，对所述重组谷氨酸棒杆菌进行好氧发 酵生产1，3-丙二醇和谷氨酸。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述好氧发酵的发酵培养基中各组分的 含量为：糖 10_150g/L、甘油 10-50g/L、ΚΗ2Ρ040· 5-5g/L、MgS040 . 2-5g/L、MnS040 . 001-lg/ L、FeS040 . 001-lg/L、玉米浆l-50g/L、（NH4)2S04l-20g/L、盐酸硫胺素 0· 001-lg/L、维生素 B120.001-lg/L〇8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述好氧发酵的条件包括： 所述谷氨酸棒杆菌的接种量为1-20体积％ ;发酵温度为28-35Γ;通过流加氨水控制pH值在5-8 ;控制溶氧值在10%以上。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括在发酵结束后收集发酵液， 对所述发酵液进行硫酸酸化结晶获得谷氨酸晶体和第二处理发酵液，再对所述第二处理发 酵液进行浓缩精馏获得1，3-丙二醇。10. -种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，在所述重组谷氨酸棒杆菌中： 1) 含有1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因； 2) 含有1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子的编码基因或者甘油脱水酶及其激活因子的 编码基因； 3) 内源ldhA基因被敲除。
【专利摘要】本发明公开了一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵联产1，3-丙二醇和谷氨酸的方法，包括通过以下步骤获得重组谷氨酸棒杆菌：1)在谷氨酸棒杆菌中引入1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因；2)在谷氨酸棒杆菌中引入1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子的编码基因或者引入甘油脱水酶及其激活因子的编码基因。本发明所提供的方法采用了谷氨酸棒杆菌为生产菌株，解决了生物安全性的问题，降低了菌体处理的成本。本发明所提供的方法充分耦联谷氨酸和1，3-丙二醇生产过程，使得还原力得到充分利用。在不降低谷氨酸得率的同时，获得极高的1，3-丙二醇对甘油的质量转化率，而且反应的副产物少，分离过程简便。
【IPC分类】C12P7/18, C12R1/15, C12P13/14, C12N1/21
【公开号】CN105400831
【申请号】CN201510890661
【发明人】陈振, 刘德华, 黄金海
【申请人】清华大学, 东莞深圳清华大学研究院创新中心
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月7日