0，2.4Hz)与 相应酯羰基碳0C175.1)的相关性表明2-甲基丁酰氧基位于C-3(SC72.6)位上。根据HMBC谱 中H-17与C-20，C-21和C-22的相关性，可推断呋喃环位于C-17位上。ROESY谱中H-6与Me-29， 1〇-29与!1-20，!1-20与]\^-19以及16-19与]^-3〇的相关性表明!1-20，!1-6，]\^-19，]^-29和]\^-30为财勾型 ;15,6(12.8抱）的耦合常数以及1?(^￥谱中!1-5与!1-9，!1-9与16-18的相关性表明了 H-5，H_9和Me-18为α构型。此外，ROESY谱中Η-υβ与H-17为交叉峰，说明了H-17为β构型。综 合氢谱、碳谱、HMBC谱和ROESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如 图1所示，立体构型进一步通过Ε⑶试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
[0025]实施例2:化合物（I)药理作用试验 [0026] -、材料和仪器
[0027]Κ562细胞由中科院上海生物细胞所提供。化合物（I)为自制，HPLC归一化纯度大于 98%ΑΡΜΙ-1640干粉培养基购于Gibco公司。小牛血清购于杭州四季青生物工程材料研究 所。青霉素、链霉素购于华北制药厂。Glutamine、MTT、DMSO购于AMRESOLAnnexinv-FITC细 胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。M0PS，Rnasin、琼脂糖、嗅乙锭、溴 酚兰华美生物工程公司华美生物工程公司。
[0028] C02孵箱（美国Thermo公司），超净工作台（苏州净化设备厂），磁力搅拌器(上海南 汇电讯器材厂），倒置显微镜（日本OLYMPUS公司），水平式离心机(上海安亭科学仪器厂），电 子分析天平(德国Sartorius公司），自动酶标仪(德国Humareader公司），U-3010型紫外分光 光度计（日本HITACHI公司），流式细胞仪（美国BECKMAN公司），EppendorfCentrifuge 5417R离心机(德国Eppendorf公司）。
[0029]二、试验方法 [0030] 1、K562细胞的培养
[0031]将新购买的细胞株的培养瓶表面用75%酒精擦拭3遍。将细胞悬液吸入离心管，lOOOrpm离心10min。弃去上清，滴加含10%NBS的RPMI-1640完全培养基，轻轻吹打制备成细 胞悬液。接种于培养瓶中，置于37°C，5%C02培养箱中培养，每天换液传代。
[0032] 2、实验分组
[0033]正常对照组：10%NBS的RPMI-1640;实验组：D1:10%NBS的RPMI-1640+终浓度 100mg/L化合物（I) ;D2:10%NBS的即RPMI-1640+终浓度200mg/L化合物（I) ;D3:10%NBS的 即RPMI-1640+终浓度400π^/1 化合物（I) ;D4:10%NBS的即RPMI-1640+终浓度800mg/L化合 物⑴。
[0034] 3、MTT法检测化合物（I)对K562细胞增殖的影响
[0035] (1)取生长状态良好的细胞，用含10%NBS的RPMI-1640培养液将细胞配制成细胞 悬液，以5X103细胞/孔接种于无菌96孔培养板中。（2)依实验分组，每组加入不同浓度的药 物50yL，设无细胞孔为空白对照组，每组设8个复孔，将96孔培养板放入C02培养箱中培养； (3) 24、48和72h后取出96孔培养板，每孔加入20yLMTT(5mg/mL)，放入C02培养箱中孵育4h， 即有紫蓝色结晶物生成，在一定细胞数范围内，结晶物的生成量与细胞数成正比。（4)每孔 加入酸化的SDS1OOyL放入C02培养箱中过夜。（5)用酶标仪测定0D，比色时以空白孔调零。 [0036] 4、AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡
[0037] (1)取生长状态好的细胞，用含10%NBS的RPMI-1640培养液将细胞配制成细胞悬 液，并调整细胞浓度为5X105/mL，接种于无菌6孔培养板，每孔2mL细胞。（2)依实验分组加 入不同浓度药物，2mL/孔，将6孔培养板放入C02培养箱中培养。（3)48h和72h后收集各孔细 胞于离心管中，lOOOrpm离心5min，弃上清。（4)用4°C预冷的PBS洗涤细胞两次，（1500rpm，离 心5min)，弃上清，用200yLBindingBuffer悬浮细胞，并移入流式管中。（5)每管加入5μ LAnnexinv-FITC混合后，加入5yLPI，混匀。（6)室温，避光反应lOmin，用流式细胞仪检测。 [0038] 5、统计学处理
[0039] 实验组和对照组均重复3次操作，结果用(x±s表示，P〈0.05示有显著性差异。组间 比较采用单因素方差分析。所有数据用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。
[0040]三、结果及结论
[0041 ] 1、MTT法检测化合物(I)对K562细胞的增殖抑制作用
[0042] 化合物（I)作用K562细胞24h、48h、72h后，用酶标仪检测0D49Q显示:作用24h后D1和D2实验组对细胞K562细胞抑制作用不明显(P>0.05，P>0.05)，D3和D4可明显抑制562结果(P 〈0.05，？〈0.01)，作用4811和7211后，不同浓度的化合物（1)均可抑制1(562细胞增殖，且随剂量 和时间的增加抑制细胞增殖的作用增强。结果见表1 (*:和对照比P〈〇. 05; :和对照KP〈 0·01)〇
[0043] 2、Annexinv-FITC/PI双染流式细胞仪分析结果
[0044] 磷脂酞丝氨酸(PhosphotidylSerine，PS)外翻是细胞凋亡的早期事件。AnnexinV是一种Ca2 +依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。先后标记了FITC和PI (PropidiumIodide)的双染细胞，可通过流式细胞仪将活细胞、早期凋亡细胞(双参数散点 图右下象限）、晚期凋亡细胞及坏死细胞区分开。结果表明不同浓度的化合物（I)作用K562 细胞48h和72h均可明显诱导K562细胞早期凋亡，这种效应随化合物（I)的浓度增加和作用 时间延长而明显增强。结果见表2(*:和对照比P〈0.05;#:和对照比P〈0.01)。
[0045]结论，化合物（I)可直接抑制K562细胞的增殖，抑制能力随浓度的增加和作用时间 的延长而增强。同时，化合物（I)可诱导K562细胞凋亡，且这种促凋亡的效应随着浓度和时 间的增加而增加。研究结果显示，化合物（I)可能为慢性粒细胞白血病的治疗提供一种潜在 的手段。
[0046] 表1不同浓度的化合物（I)作用K562细胞后的MTT值(X土s，N=8)
[0047]
[0048] 表2不同浓度化合物（I)作用K562细胞后早期凋亡率(x土s，N=3)
[0049]
[0050] 实施例3
[0051] 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0052] 实施例4
[0053] 口服液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口 服液。
[0054] 实施例5
[0055] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0056] 实施例6
[0057] 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0058] 实施例7
[0059] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
[0060]上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，O2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：（a)将白鲜 的干燥根皮粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、 乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取 物；（b)步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用 75%乙醇洗脱10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步 骤(b)中75 %乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、40:1、20:1、12:1和1:1 的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次 用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2 用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收 集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用80%乙醇 热回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了用于治疗慢性粒细胞白血病的柠檬苦素化合物及制备方法，提供了该化合物结构，含其的药物组合物及其制备方法和应用。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的柠檬苦素类化合物，可以从白鲜的干燥根皮中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物可直接抑制K562细胞的增殖，抑制能力随浓度的增加和作用时间的延长而增强。同时，其可诱导K562细胞凋亡，且这种促凋亡的效应随着浓度和时间的增加而增加。化合物(Ⅰ)为慢性粒细胞白血病的治疗提供一种潜在的手段，可以用来开发成治疗慢性粒细胞白血病的药物。
【IPC分类】A61P35/02, A61K31/585, C07J73/00
【公开号】CN105418729
【申请号】CN201511018309
【发明人】吴金凤
【申请人】吴金凤
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月30日