一种重组抗双酚a单克隆抗体及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新的抗双酚A单克隆抗体，及其制备方 法和用途。
【背景技术】
[0002] 双酚A，也称BPA，是重要的有机化工原料，苯酚和丙酮的重要衍生物，工业上又叫 作聚碳酸酯。双酚A是世界上使用最广泛的工业化合物之一，主要用于生产聚碳酸酯、环氧 树脂、聚砜树脂、聚苯醚树脂、不饱和聚酯树脂等多种高分子材料。也可用于生产增塑剂、阻 燃剂、抗氧剂、热稳定剂、橡胶防老剂、农药、涂料等精细化工产品。
[0003] 在塑料制品的制造过程中，添加双酚A可以使其具有无色透明、耐用、轻巧和突出 的防冲击性等特性，尤其能防止酸性蔬菜和水果从内部侵蚀金属容器，因此广泛用于罐头 食品和饮料的包装、奶瓶、水瓶、牙齿填充物所用的密封胶、眼镜片以及其他数百种日用品 的制造过程中。双酚A在生活中应用广泛，成为人们经常能接触到的物质。
[0004] 资料表明，双酚A属低毒性化学物。动物试验发现双酚A有模拟雌激素的效果，即 使很低的剂量也能使动物产生雌性早熟、精子数下降、前列腺增长等作用。此外，有资料显 示双酚A具有一定的胚胎毒性和致畸性，可明显增加动物卵巢癌、前列腺癌、白血病等癌症 的发生。
[0005] 研究表明，当含有双酚A的塑料奶瓶被加热时，双酚A极易从奶瓶中释放出来，转 移至与其接触的食品中，对婴幼的身体健康产生危害。
[0006] 目前较多国家对双酚A不是限用，而是禁止使用了，同时目前我国GB 13116 - 1991食品容器及包装材料用聚碳酸酯树脂卫生标准规定了酚的溶出量应低于0. 05mg/L。 另外国家已经发布了双酚A标准包括《GB/T23296. 16-2009食品接触材料高分子材料食品 模拟物中2,2-二（4-羟基苯基）丙烷（双酚々的测定高效液相色谱法》、《5~八2282-2009 食品接触材料高分子材料食品模拟物中双酚A的测定高效液相色谱法》、《SN/T2379-2009 聚碳酸酯树脂及其成型品中双酚A的测定气相色谱-质谱法》、《SN/T2407-2009玩具中苯 酚和双酚A的测定》，已立项尚未发布的国家标准包括《20090893-T-607食品塑料包材中 双酚A残留量的测定（超高压液相色谱法）》。但这些常用HPLC的检测方法的检测低限为 0. lmg/L，达不到GB 13116 - 1991食品容器及包装材料用聚碳酸酯树脂卫生标准规定了酚 的溶出量应低于〇. 〇5mg/L。另外这些检测方法存在检测成本高，检测样本数量有限，对检测 员前期技能培训要求较高等弊端。
[0007] 与常规仪器检测方法相比，ELISA法具有特异性强、操作简便、仪器化程度和分析 成本低、检测时间短、样品容量大等优点，尤其适用于大规模样本的快速检测。因此建立的 高通量检测方法能够确保快速大批量检测样品，为保证食品接触材料达到相应的安全标准 提供检测基础。
[0008] 现有技术中，还未有能够高效检测双酚A的方法的报道。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种重组抗双酚A单克隆抗体及 其制备方法和用途。
[0010] 本发明的第一方面提供了一种重组抗双酚A单克隆抗体，所述抗体含有轻链可变 区和重链可变区，轻链可变区具有SEQ ID N0 :3所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。
[0011] 本发明第二方面提供了一种多核苷酸，其编码所述重组抗双酚A单克隆抗体。
[0012] 本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
[0013] 编码所述单克隆抗体的多核苷酸序列可以通过本领域技术人员熟知的任何适当 的技术制备。所述技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等， 科学出版社，1995)。包括但不限于重组DNA技术、化学合成等方法。
[0014] 在本案的较佳实施例中，编码上述单克隆抗体的多核苷酸为DNA分子，所述DNA分 子含有SEQ ID N0 :1所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区核苷酸序列，以及SEQ ID N0 : 2所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列。
[0015] 本发明第三方面提供了一种表达载体，其含有所述多核苷酸以及与该序列操作性 相连的表达调控序列。
[0016] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述载体。这些方法包括重组DNA技 术、DNA合成技术等。可将编码所述单克隆抗体的DNA有效连接到载体中的多克隆位点上， 以指导mRNA合成进而表达蛋白，或者用于同源重组。
[0017] 较佳的，所述载体为原核载体或穿梭质粒等。
[0018] 本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其被所述载体所转化。
[0019] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门菌、李斯 特细菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO, C0S. 293细胞、或 Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
[0020] 本发明第五方面提供了一种制备上述重组单克隆抗体的方法，该方法具体包括如 下步骤：
[0021] a)获得目的基因片段；
[0022] b)将目的基因融合片段插入表达载体中；
[0023] c)将获得的表达载体转化真核宿主细胞；
[0024] d)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤c)所得的真核宿主细胞；
[0025] e)分离纯化获得所述重组单克隆抗体。
[0026] 较佳的，步骤a)中，所述目的基因含有SEQ ID N0:1所示的编码所述单克隆抗体 轻链可变区核苷酸序列，以及SEQ ID N0 :2所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷 酸序列。
[0027] 较佳的，步骤b)中，所述表达载体可以是常规的原核系统表达载体，优选pNP表达 载体。
[0028] 较佳的，步骤c)中，可将获得的表达载体转化大肠杆菌，优选大肠杆菌DH5a ;宿主 细胞，可优选CHO细胞。
[0029] 较佳的，步骤e)中，分离纯化方法为：用ProteinA亲和层析柱从细胞培养上清中 直接分离纯化出上述单克隆抗体。
[0030] 本发明第六方面，提供了所述的重组单克隆抗体在定性或定量检测双酚A中的用 途。
[0031] 本发明的第七方面提供了一种采用所述抗双酚A单克隆抗体在检测双酚A的方 法。较佳的，所述的方法为ELISA法。
[0032] 本发明的有益效果为：
[0033] 本发明的重组单克隆抗体能快速、灵敏地检测食品包装材料中双酚A的含量。检 测低限将达到〇. 〇〇lug/ml，具有极高的选择性和灵敏性，使有毒有害物分析的过程步骤大 大简化。
【附图说明】
[0034] 图1 :本发明所构建的pNP(H+L)载体。含有重组抗双酚A抗体轻链全长基因和重 链全长基因。其中，hCMV pro为人巨细胞病毒早期启动子；Ck为销售κ轻链恒定区基因； IgG constant为销售γ1重链恒定区基因；pA为多聚腺苷化信号；DHFR为二氢叶酸还原酶 基因；AmpR为氨苄青霉素抗性基因。
[0035] 图2 :抗双酚A单克隆抗体SDS电泳图。Μ泳道为蛋白分子量Marker，DTT+泳道为 抗体还原状态，DTT-泳道为抗体非还原状态。
【具体实施方式】
[0036] 本发明涉及一种重组的抗双酚A单克隆抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变 区，轻链可变区具有SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID N0 :2所示的 氨基酸序列。
[0037] 本文所用的术语"单克隆抗体（单抗）"指从一类基本均一的群体获得的抗体，即 该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高 特异性地针对单个抗原点。而且，与常规多克隆抗体制剂（通常具有针对不同决定簇的不 同抗体）不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗 体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语"单 克隆"表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特 殊方法来产生抗体。
[0038] 本文所用的术语"抗体"和"免疫球蛋白"是有相同结构特征的约150000道尔顿 的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链（L)和两个相同的重链（H)组成。每条轻链通过一 个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重 链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区（VH)，其后是多个恒定区。 每条轻链的一端由可变区（VL)，另一端有恒定区：轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相 对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸在轻链和重链的可变区之间形成界 面。
[0039] 本文所用的术语"可变"表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成 各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可 变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区（CDR)或超变区中的三个片段中。 可变区中较保守的部分称为架构区（FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区， 它们大致上呈P -折叠构型，由形成接连环的三个⑶R相连，在某些情况下可形成部分P折 叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR -起形成了抗体的 抗原结合部位（参见Kabat等，NIH PuB，No. 91-3242,卷I，647-669页（1991))，恒定区不 直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗 体的细胞毒性。
[0040] 单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法