大麦和两种野生型大麦检测的电泳图谱;其中1、2、4为糯大麦、3、5为 非懦大麦。
[0024] 图2为糯大麦X野生型大麦杂交F2株系植株检测的电泳图谱;其中1、2、4、8和10别 为糯大麦株系，即扩增出760bp左右的条带，而3、5、6、7、9和11为非糯大麦野生型株系，即能 扩增出970bp左右的条带。
【具体实施方式】
[0025] 下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0026] 实施例1
[0027] 设计特异性引物waxy-p，其核苷酸序列如下：
[0028] 上游引物序列，5-AGGCATGCAGCAGCGTGAGT-3'（SEQ ID N0.1)
[0029] 下游引物序列，5-CACTGATCGTCAGTGTGAGT-3'（SEQ ID N0.2)。
[0030] 将以上设计的引物对三个糯大麦和两个野生型大麦进行PCR扩增，PCR扩增体系：5 yL 10XPCR buffer、1.5U Ex TaqTM DNA聚合酶、2mmol/l MgCl2、0.2mmol/L dNTP、上下游 引物各150ng，lOOng模板DNA、双蒸水加至总量为50yL; PCR程序:94°C预变性5min; 94°C变性 30s、60°C退火45s、72°C延伸30s，总共35个循环;72°C延伸5min;将得到的产物用1.5 %的琼 脂糖凝胶电泳分离，电极缓冲液为1XTAE，恒定电压150V，电流180A。电泳结果(见图1)发现 该引物对能很好得区分非糯性野生型大麦和糯大麦。
[0031] 实施例2
[0032] (1)利用糯大麦JM-1为母本，非糯性野生型大麦JM-10为父本进行杂交，获得F1后， 自交获得F2，在F2后代株系中随机选择11个株系。
[0033] (2)对所获得的11个株系进行waxy-p标记检测，具体方法为:在苗期提取11个株系 的DNA;以其为底物，以特异性引物对为引物进行PCR扩增，所述引物为：
[0034] 上游引物序列，5-AGGCATGCAGCAGCGTGAGT-3'（SEQ ID N0.1)
[0035] 下游引物序列，5-CACTGATCGTCAGTGTGAGT-3'（SEQ ID N0.2)。
[0036] PCR扩增体系：5yL 10XPCR buffer、1.5U Ex TaqTM DNA聚合酶、2mmol/l MgCl2、 0.2mmol/L dNTP、上下游引物各150ng，lOOng模板DNA、双蒸水加至总量为50yL; PCR程序:94 °C预变性5min; 94°C变性30s、60°C退火45s、72°C延伸30s，总共35个循环;72°C延伸5min;将 得到的产物用1.5 %的琼脂糖凝胶电泳分离，电极缓冲液为1 X TAE，恒定电压150V，电流 180A。电泳结果(见图2)发现其中5个植株具有糯大麦的等位位点，6个植株具有非糯性大麦 的等位位点，即1、2、4、8、10扩增出了一条与糯大麦一致的760bp左右的条带为糯大麦株系， 3、5、6、7、9、11同非糯性大麦一样未能扩增出76(^?而是97(^?左右的条带，为非糯性野生型 大麦株系。
[0037]表1糯大麦JM-lx非糯性野生型大麦JM-10F2代部分株系的
[0038]电泳结果统计
[0039]
[0040]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 鉴定大麦糯性性状的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列为： 正向引物:5 ' -AGGCATGCAGCAGCGTGAGT-3 ' ； 反向引物:5'-CACTGATCGTCAGTGTGAGT-3'。2. -种鉴定大麦糯性性状的方法，其特征在于，所述方法包括，以待测大麦基因组DNA 为模板，利用权利要求1所述的特异性引物进行PCR扩增获得扩增片段，检测扩增片段的长 度，当扩增片段的长度为760bp时鉴定待测大麦具有糯性性状。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在，所述PCR扩增的反应程序为:94~95°C预变性 5 ~8min;94 ~95°C 变性 45 ~608,60~63°(3退火40~508,71~73°(3延伸40~508，共30~35 个循环;71~74°C终延伸4~6min。4. 根据权利要求2或3所述所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：5yL 10XPCR缓冲液、1.5U Ex TaqTM DNA聚合酶、2mmol/l MgCl2、0.2mmol/L dNTP、上下游引物 各150ng，100ng模板DNA、双蒸水加至反应体系总量为50yL。5. -种大麦糯性性状检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的特异 性引物。6. 权利要求1所述的引物在大麦waxy基因型鉴定中的应用，其特征在于，所述应用包括 利用权利要求1所述的特异性引物进行PCR扩增获得扩增片段，检测扩增片段的长度，当扩 增片段的长度为760bp时鉴定待测大麦的waxy基因为糯性基因型，当扩增片段的长度为 970bp时鉴定待测大麦的waxy基因为非懦性基因型。7. 权利要求1所述的特异性引物在大麦种质资源改良中的应用。8. 权利要求1所述的特异性引物在大麦育种中的应用。
【专利摘要】本发明提供了鉴定大麦糯性性状的特异性引物及其应用，以及鉴定大麦糯性性状的方法，本发明所开发的特异性引物的靶序列为共显性标记，可以用于鉴定大麦是否为糯大麦，检测方便、扩增稳定、简单易行。可以直接对杂交后代材料进行目的基因的扩增检测，不但能从基因分子水平上对杂交后代的真假做出判断，而且在连续的自交与回交育种过程中能够追踪检测基因的转移与存在，并且本发明所提供的鉴定方法简单，结果可靠，弥补了形态学鉴定的粗放，利用该方法，将使后续研究更具目的性与针对性，对选育兼具其他优良品质的糯大麦具有重要作用。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105525021
【申请号】CN201610074062
【发明人】马建, 兰秀锦, 孙敏, 郑有良, 魏育明, 江千涛, 刘亚西, 祁鹏飞, 陈国跃
【申请人】四川农业大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年2月2日