y-4-methyl-2H-chromen-2-〇ne)
[0078] 将lOmmol的4-甲基-7-羟基-苯并吡喃-2-酮加入到无水DMF溶液中，加入 lOmmol氢化钠与lOmmol碘甲烷，反应结束后用水淬灭反应，将DMF蒸干后硅胶柱拌样，石油 醚：乙酸乙酯（1:1)洗脱分离。
[0079]
[0080] 4_ 氯甲基 _7,8_ 羟基-苯并吡喃-2-酮（4-(chloromethyl)_7， 8-dihydroxy-2H-chromen-2-〇ne)
[0081] 将lOmmol的连苯三酸和lOmmol的氯甲基乙酰乙酸乙酯与10ml70% H2S04混合搅 拌均匀，室温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入20ml水，有大量固体析出，过滤 洗涤固体化合物，将固体产物烘干，70%乙醇/水溶液重结晶
[0082]
[0083] 4_ 乙酸甲酯基 _7_ 控-苯开吡喃 _2_ ? (7-hydroxy-4_acetate methy-2H-chromen-2-〇ne)
[0084] 将lOmmol的间苯二酸和lOmmol的丙酮二羧酸二甲酯与10ml70%氏304混合搅拌 均匀，室温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入20ml水，有大量固体析出，过滤洗 涤固体化合物，将固体产物烘干，70%乙醇/水溶液重结晶
[0085]
[0086] 4-甲基 _7_ 羟基-苯并P比喃 _2_ 酮（7-hydroxy-4-methyl-2H-chromen-2-〇ne)
[0087] 将lOmmol的间苯二酸和lOmmol的乙酰乙酸乙酯与10ml70% H2S〇d§合搅拌均勾， 室温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入20ml水，有大量固体析出，过滤洗涤固体 化合物，将固体产物烘干，70%乙醇/水溶液重结晶
[0088]
[0089] 4-乙駿基 _7_ 羟基-苯并 P比喃 _2_ 酮（7_hydroxy-4-acetic ac i d-2H-chromen-2-〇ne)
[0090] 将lOmmol的间苯二酸和lOmmol的丙酮二羧酸与10ml70% ]^04混合搅拌均勾， 室温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入20ml水，有大量固体析出，过滤洗涤固体 化合物，将固体产物烘干，70%乙醇/水溶液重结晶
[0091]
[0092] 3_ 氯-4-甲基 _7,8_ 羟基-苯并吡喃-2-酮（3-chloro_7,8-dihydroxy-4_methy l-2H-chromen_2-〇ne)
[0093] 将lOmmol的间苯二酸和lOmmol的2-氯乙酰乙酸乙酯与10ml70% H2S04混合搅 拌均匀，室温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入20ml水，有大量固体析出，过滤 洗涤固体化合物，将固体产物烘干，70%乙醇/水溶液重结晶
[0094]
[0095] 4_ 甲基 _7,8_ 羟基-苯并P比喃 _2_ 酮（7,8-dihydroxy-4-methyl-2H-chromen-2-one)
[0096] 将lOmmol的连苯三酸和lOmmol的乙酰乙酸乙酯与10ml70% H2S〇d§合搅拌均勾， 室温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入20ml水，有大量固体析出，过滤洗涤固体 化合物，将固体产物烘干，70%乙醇/水溶液重结晶
[0097] υινιβ
[0098] 3_ 乙酰基-8-甲氧基苯并吡喃 _2_ 酮（3-acetyl-8-methoxy-2H-chromen-2_one)
[0099] 将lOmmol的3-甲氧基邻羟基苯甲醛和lOmmol的乙酰乙酸乙酯与10%催化量哌 啶混合搅拌均匀，室温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入20ml水，有大量固体析 出，过滤洗涤固体化合物，将固体产物烘干，70%乙醇/水溶液重结晶
[0100]
[0101] 4_ 乙酸甲酯基-7,8_ 羟基-苯并吡喃 _2_ 酮（7,8-dihydroxy-4_acetate methy-2H-chromen-2-〇ne)
[0102] 将lOmmol的连苯三酸和lOmmol的丙酮二羧酸二甲酯与10ml70%氏304混合搅拌 均匀，室温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入20ml水，有大量固体析出，过滤洗 涤固体化合物，将固体产物烘干，70%乙醇/水溶液重结晶
[0103]
[0104] 3_ 乙醜基 _6_ 漠-苯并吡喃 _2_ 酬（3-acetyl-6-brom〇-2H-chromen_2-〇ne)
[0105] 将lOmmol的5-溴邻羟基苯甲醛和lOmmol的乙酰乙酸乙酯与10%催化量哌啶混 合搅拌均匀，室温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入20ml水，有大量固体析出， 过滤洗涤固体化合物，将固体产物烘干，70%乙醇/水溶液重结晶
[0106]
[0107] 4_ 丁基 _7,8_ 羟基-苯并吡喃 _2_ 酮（7,8-dihydroxy-4-propyl-2H-ch;romen-2-one)
[0108] 将lOmmol的连苯三酸和lOmmol的丁酰乙酸乙酯与10ml70% ]^04混合搅拌均勾， 室温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入20ml水，有大量固体析出，过滤洗涤固体 化合物，将固体产物烘干，70%乙醇/水溶液重结晶。
[0109] 本发明香豆素类化合物与瞬时离子通道蛋白TRPV3亚型的作用机制研究
[0110] TRPV3通道是一种阳离子非选择性通道，可以大量通透钙离子，本发明采用Flex Station3技术与电生理技术对合成的化合物进行活性筛选。Flex Station3技术是一种基 于钙荧光的高通量筛选技术，可应用该方法对TRPV3通道的调节剂进行筛选；电生理技术 主要应用全细胞式记录方法，应用HEKA EPC10放大器系统及PatchMaster记录软件（玻璃 微电极阻值为3-5M Ω，细胞钳制电位为〇mV，使用-80mV和+80mV方波电压记录）。
[0111] 实验应用HEK293细胞，接种于24孔板中，37°(：、5%0)2培养过夜。瞬时转染 pIRES_EGFP/hTRPV3 质粒（Cao et al, Intracellular proton-mediated activation of TRPV3channels accounts for the exfoliation effect of alpha-hydroxyl acids on keratinocytes，Journal of Biological Chemistry,Vol. 287,No. 31，25905-25916)，换 液时传代至96孔板，细胞密度约为50,000每孔。转染后24h时进行染料孵育，所用染料 为Cal-520assay kit。吸出40μ1培养基，此时96孔板中剩余60μ1培养基，加入等量 的Cal-520染料，孵箱孵育1. 5小时可上机检测。Flex Station系统激发波长490nm，发 射波长525nm，每间隔1. 6s读数一次。17s时加入待测化合物，100s时加入TRPV3激动剂 2-APB (2-氨基乙氧基联苯硼酸盐）（终浓度200 μ M)，每次测试共计180s。对于拮抗剂，其 筛选实验的荧光特征应为加入2-APB后荧光值没有明显上升；浓度依赖特性应表现为随着 化合物浓度的递减对通道的抑制效应减弱，即加入激动剂2-APB后，荧光信号随化合物孵 育浓度下降而增高。
[0112] 结果表明，化合物
[0113] FHZ-1(7,8-dihydroxy-4-trifluoromethyl-2H-chromen-2-〇ne)n
[0114] FHZ-3(3_brom〇-7,8-dihydroxy-4-methyl-2H-chromen-2-〇ne)、
[0115] FHZ-5(3-fluor〇-7,8-dihydroxy-4-methyl-2H-chromen-2-〇ne)、和
[0116] FHZ-7(7,8-dihydroxy-4-phenyl-2H-chromen-2-〇ne)
[0117] 能够抑制2-APB引起的TRPV3通道激活（见图1)
[0118] 图1的解释：瑞香素衍生物（FHZ-l、FHZ-3、FHZ-5、FHZ-7)抑制TRPV3通道的作用。 图中升高的深蓝信号为阳性药2-APB (300 μ M)。筛选采用FlexStation3作站检测化合物对 通道的作用。17s时，给予瞬时转染TRPV3通道的HEK293细胞不同浓度的化合物或2-ABP
[0119] 从单浓度筛选得到的苗头化合物（图1)，进一步采用FlexStation3工作站对瑞香 素衍生化合物3(FHZ-3)和7(FHZ-7)进行了浓度梯度的筛选确认（图2)。结果表明，化合 物3和7能够剂量依赖的抑制2-APB引起的TRPV3通道激活（图2)。
[0120] 图2的解释：瑞香素衍生物FHZ-3和FHX-7抑制TRPV3通道的量效关系。筛选采用 FlexStation3作站检测化合物对通道的作用。17s时，给予瞬时转染TRPV3通道的HEK293 细胞不同浓度的化合物或2-ABP
[0121] 为了初步确定上面化合物FHZ-1、FHZ-3、FHZ-5和FHZ-7的选择性，首选在表达 TRPV1、TRPV4和TRPA1表达细胞并在测定了这些化合物的通道选择性（图3)。结果表明， 瑞香素衍生物1、3、5和7对其它TRP通道没有抑制作用。
[0122] 图 3 的解释：瑞香素衍生物 1、3、5 和 7(FHZ-l、FHZ-3、FHZ-5、FHZ-7)对其它 TRPV1、 TRPV4 和 TRPA1 通道的选择性。化合物 1、3、5 和 7 (FHZ-1、FHZ-3、FHZ-5、FHZ-7)对 TRPV1、 TRPV4和TRPA1通道没有抑制作用
[0123] 应用瞬时转染pIRES-EGFP/hTRPV3质粒的HEK293T细胞，于转染后24小时开始测 试。电极内液及外液的组成成分为130mMNaCl，0. 2mMEDTA，3mMHEPES，pH为7. 4。测试开始 待基线平稳后，给予2-APB激活TRPV3通道。电流平稳后，分别重力灌流给予不同化合物观 察其对通道的抑制作用。IC 5。曲线的绘制由重力灌流不同浓度的化合物制得。2-APB的EC5。 偏移曲线则由重力灌流不同浓度的2-APB得到。
[0124] 结果表明，给予细胞不同浓度的化合物1，TRPV3电流受到不同程度的抑制，呈现 明显的浓度依赖关系，其IC 5。值=21 ±1.0 μ Μ(图4)。
[0125] 图4瑞香素衍生物FHZ-1抑制2-APB诱导激活TRPV3通道的量-效关系曲线。图 4的左图：瞬时转染TRPV3的HEK293T细胞50 μ Μ激动剂2-APB后，正负向电流均明显增大， 通道被激活打开；在50 μ Μ 2-ΑΡΒ存在的情况下，给予浓度为100 μ Μ的化合物FHZ-1，电流 被迅速且强烈的降低，显示通道被阻断。图4的右图：Β，在50μΜ 2-ΑΡΒ存在的情况下，给 予细胞不同浓度的化合物FHZ-1 (ImM、300 μ Μ、100 μ Μ、30 μ Μ、10 μ Μ和3 μ Μ)，TRPV3电流被 不同程度的抑制，呈现明显的浓度依赖性关系。半数抑制浓度由Hill方程拟合得出
[0126] 本发明香豆素类化合物作用于小鼠瘙痒模型的研究
[0127] 在瘙痒的动物模型中，标准模型是在颈后皮内注射致痒剂产生瘙痒，观察后肢对 注射部位的搔抓行为。搔抓行为是在瘙痒研究中的一个主要指标，瘙痒的程度用搔抓的次 数或时间来衡量。搔抓一次为从后肢抬起搔抓注射部位快速的高频的挠动到后肢落地或放 入嘴中啃咬整个过程。通过记录一定时间内的搔抓次数来判断瘙痒的程度。本发明主要包 括作用于TRPV3蛋白活性最好的化合物FHZ-1用于组胺依赖的瘙痒行为学研究、氯喹引起 的瘙痒行为学研究、慢性瘙痒的行为学研究。
[0128] 1、对小鼠组胺依赖的瘙痒止痒作用行为学研究
[0129] 组胺是一种自体活性物质，是人们公认的诱导瘙痒产生的主要物质之一，在体内 由组氨酸脱羧基而成，组织中的组胺是以无活性的结合型存在于肥大细胞和嗜碱性粒细胞 的颗粒中，在皮肤含量较多。当机体受到理化刺激或发生过敏反应时，可引起这些细胞脱颗 粒，导致组胺释放，与组胺受体结合而产生生物效应。
[0130] 组胺H1受体拮抗剂以其对细胞上组胺受体位点的可逆性竞争作用而阻止组胺作 用于靶细胞，通过阻滞和拮抗H1受体而发挥抗过敏作用，以达到防止一系列生理反应的发 生。现在临床上使用的抗组胺药物主要有：第一代H1受体拮抗剂，如氯苯那敏、赛庚啶、羟 嗪等；第二代H1受体拮抗剂，如西替利嗪、氯雷他啶、咪唑斯汀、阿司咪唑等；第三代H1受 体拮抗剂，如非索非那丁、去甲基阿司咪唑、脱羧基氯雷他啶等。其中市场占有率最大、疗效 最好的药物是氯雷他定。在该试验中，选该药为阳性对照药物。
[0131] 小鼠在购进之后SPF环境恢复两天，然后每天抓拿抚摸老鼠5-10min/天，并放 到视频观察盒中适应30min，连续处理5-7天，使老鼠充分适应抓拿和视频观察，表现出 正常生理状态。取⑶1小鼠31只，随机分为3组，第一组为溶媒（PEG400:水：甘油= 996:100:40,质量比）对照组，第二组为FHZ-1组，第三组为氯雷他定组。一次灌胃给药，灌 胃体积为l〇ml/Kg。于给药后lh在颈后皮内注射组胺50yg/ Site，造成瘙痒模型，视频观 察给组胺前5min至给组胺后30min，统计给药前后的搔抓次数。结果见表1
[0132] 表1对小鼠组胺引起的瘙痒的止痒作用（i ±s )
[0133]
[0134] 注：与溶媒对照组比较*p < 0· 05 ;#p < (λ 01 < (λ 001 (下表同）
[0135] 由表1结果可见，一次灌胃给药后，FHZ-1 100mg/kg和氯雷他定10mg/kg均可明 显抑制小鼠在注射组胺后引发的搔抓次数，与溶媒对照组比较，差异显著（P < 0. 05)，且二 者作用强度相同。
[0136] 2、对小鼠氯喹引起的瘙痒止痒作用行为学研究
[0137] 氯喹最初用于疟疾的治疗，其副作用之一就是可以引起皮肤瘙痒。在之前的研究 中，皮下注射氯喹可以引发剧烈的瘙痒，而抗组胺药物对该瘙痒治疗无效。
[0138] 小鼠在购进之后SPF环境恢复两天，然后每天抓拿抚摸老鼠5-10min/天，并放 到视频观察盒中适应30min，连续处理5-7天，使老鼠充分适应抓拿和视频观察，表现出 正常生理状态。取⑶1小鼠80只，随机分为4组，第一组为溶媒（PEG400:水：甘油= 996:100:40,质量比）对照组，第二组为FHZ-1组，第三组为氯雷他定组，第四组为空白对照 组。一次灌胃给药，灌胃体积为l〇ml/Kg。于给药后lh在颈后皮内注射氯喹lOOyg/site， 造成瘙痒模型，视频观察给氯喹前5min至给氯喹后30min，统计给药前后的搔抓次数。结果 见表2
[0139] 表2对小鼠氯喹引起的瘙痒的止痒作用（)
[0140]
[0141] 由表2结果可见，一次灌胃给药后，FHZ-1 100mg/kg可明显抑制小鼠在注射氯喹 后引发的搔抓次数，与氯喹+溶媒对照组比较，差异显著（P < 0. 05)，而氯雷他定不能抑制 氣陸引起的痛痒；
[0142] 3、对小鼠慢性瘙痒的止痒作用行为学研究
[0143] 慢性瘙痒是很多皮肤性疾病和系统性疾病的并发症状，在临床上的治愈率很低。 急性瘙痒可以帮助人们防止蚊虫的叮咬、清除侵害皮肤的物质等，但慢性瘙痒会产生持续 的剧痒，其引起搔抓行为也会进一步