酸序列靶标并由此在合适条件下起始合成。每个引物退火至各自的 靶核酸分子内部或相邻区域，使得每个扩增产物的至少一部分含有对应于各自靶标和SNP (如果存在）的核酸序列。产生扩增产物的前提是样品中存在靶核酸，靶核酸分子中是否存 在所关注的SNP。
[0020] 方法还可包括杂交步骤，所述杂交步骤包括使扩增产物与包含核酸序列的SNP特 异性水解探针接触，所述核酸序列与扩增产物的含有SNP的区域互补。SNP特异性水解探针 可包含第一和第二可相互作用的标记、5'端和3'端以及偏向3'端的发夹结构。发夹结构可 被设计成包含非天然存在的核酸区域，所述非天然存在的核酸区域可包含一个或多个改变 的核苷酸(其不属于天然存在的序列的一部分），或可包含一个或多个额外的非天然存在的 核苷酸(其为添加到天然存在的序列中的核苷酸），以产生所述发夹结构。这样，正常情况下 不会在3'端形成发夹结构的核酸序列可经过设计而形成发夹，这通过例如改变核酸序列 (例如，在偏向3 '端的序列中改变一个或多个核苷酸)或通过在核酸序列的3 '端添加一个或 多个核苷酸。
[0021] 为了检测样品中的核酸靶标是否存在所关注的SNP，通过从SNP特异性水解探针释 放的可检测的标记来检测扩增产物。如果通过SNP特异性水解探针检测到了扩增产物，则表 明存在SNP。如果相反，通过SNP特异性水解探针没有检测到扩增产物，则表明不存在SNP。因 此，存在扩增产物表明靶核酸靶标中存在SNP，而不存在扩增产物则表明靶核酸靶标中不存 在 SNP。
[0022] 如本文中所用，术语"扩增"指代合成与模板核酸分子（例如，人类免疫缺陷病毒 (HIV)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)或丙型肝炎病毒(HCV)的革巴核 酸分子)的一条或两条链互补的核酸分子的方法。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性、 将引物以低于引物解链温度的温度退火至模板核酸以及从引物酶促延长以生成扩增产物。 扩增通常需要存在脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶(例如，Platinum ? Taq)以及合适的缓 冲液和/或使聚合酶活性最优化的辅因子(例如，MgCl2和/或KC1)。
[0023] 本文中所用的术语"引物"是本领域技术人员已知的并且指代寡聚化合物，主要指 寡核苷酸但也指能够通过模板依赖型DNA聚合酶"引发" DNA合成的经修饰的寡核苷酸，即， 例如，寡核苷酸的3'端提供游离的3'-OH基团，而另外的"核苷酸"可以通过模板依赖型DNA 聚合酶被连接到其上形成3'至5'磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸并由此释放焦磷 酸。一般来讲，引物是基于已知的模板序列而设计的。一种引物引发有义链，而另一种则引 发靶DNA或cDNA的互补链。PCR可以在均一的靶DNA或RNA(即，具有相同序列的靶标)上或在 混合的靶DNA或RNA(即，具有侧接保守序列的不同间插序列的靶标）上进行。对于混合的 DNA/RNA(例如，含有序列异质性），如果靶标的序列与错配的引物（即，容错引物(tolerant primer))具有足够的互补性，即使是错配的引物也可以在PCR反应中起作用。
[0024] 术语"杂交"指代一个或多个探针退火至扩增产物。杂交条件通常包括低于探针的 解链温度但避免探针的非特异性杂交的温度。
[0025] 术语"5 '至3 '核酸外切酶活性"指代核酸聚合酶的活性，其通常与核酸链的合成有 关，由此核苷酸从核酸链的5 '端被移除。
[0026] 术语"热稳定聚合酶"指代是热稳定的聚合酶，即，该酶催化与模板互补的引物延 伸产物的形成，并且当其经受引起双链模板核酸变性所必要的时间的高温时，不会不可逆 地变性。一般来讲，合成起始于每个引物的3'端并以5'至3'的方向沿着模板链进行。已经从 黄栖热菌(Thermus flavus)、红栖热菌(T. ruber)、嗜热栖热菌(T. thermophilus)、水生 栖热菌(T. aquaticus)、乳栖热菌(T. lacteus)、红色栖热菌(T. rubens)、嗜热脂肪芽孢 杆菌（Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烧嗜热菌（Methanothermus fervidus)中 分离出了热稳定聚合酶。尽管如此，非热稳定的聚合酶也可被用于PCR测定，但前提是再补 充该酶。
[0027]术语"其互补体(complement)"指代与给定的核酸不仅长度相同并且还完全互补 的核酸。
[0028] 当关于核酸而使用时，术语"延伸"或"伸长"指代额外的核苷酸(或其它类似分子） 被掺入到核酸中的情况。例如，核酸任选地通过掺入核苷酸的生物催化剂延伸，如聚合酶， 其通常在核酸的3'末端添加核苷酸。
[0029] 在两个或更多个核酸序列的语境中，术语"相同的"或百分比"同一性"指代当就最 大对应程度进行比较和比对(例如，如使用技术人员可获得的序列比较算法之一或通过目 测进行测量的）时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有特定百分比的相同核苷酸。 适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的示例性算法为BLAST程序，其在，例如， Altschul 等人（1990)，"Basic local alignment search tool"，J. Mol. Biol. 215: 403-410, Gish 等人（1993)，"Identification of protein coding regions by database similarity search"，Nature Genet.3:266_272, Madden 等人（1996)， "Applications of network BLAST server"， Meth.Enzymol.266:131-141, Altschul 等 人（1997)， "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"，Nucleic Acids Res.25:3389_3402 以及 Zhang 等人（1997)， "PowerBLAST:A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation"，Genome Res · 7:649-656 中有述。
[0030]在寡核苷酸的语境中，"经修饰的核苷酸"指代一种改变，其中寡核苷酸序列的至 少一个核苷酸被不同的核苷酸所替换，这种改变为寡核苷酸提供了所需的特性。本文中所 述的寡核苷酸中可被取代的示例性的经修饰的核苷酸包括，例如，C5-甲基-dC、C5_乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基-dU、2,6-二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基-dA、C7_丙炔基-dG、C5_块丙基氛基-dC、C5_块丙基氛基-dU、C7_块丙基氛基-dA、C7_块丙基 氨基-dG、7-脱氮-2-脱氧黄苷、吡唑并嘧啶类似物、假dU (pseudo-dU)、硝基吡咯、硝基吲 哚、2'-0_甲基核糖(Ribo)-U、2'-0-甲基核糖-C、N4-乙基-dC、N6-甲基-dA等。本发明的寡核 苷酸中可被取代的许多其它经修饰的核苷酸要么在本文中提到，要么是本领域中已知的。 在某些实施方案中，相对于对应的未经修饰的寡核苷酸的解链温度，经修饰的核苷酸取代 改变寡核苷酸的解链温度(Tm)。为了进一步说明，在本发明的一些实施方案中，某些经修饰 的核苷酸取代可以减少非特异性核酸扩增(例如，最小化引物二聚体的形成等等）、增加预 定靶扩增子的产率等等。这些类型的核苷酸修饰的实例在，例如，美国专利号6,001，611中 有述。
[0031 ]如本文中所用，在如本文中所述的偏向探针的3 '端的发夹结构的语境中，术语"非 天然存在的核苷酸"指代这样的核苷酸，其并非在天然序列中（例如，在野生型序列中）天然 存在的核苷酸。此类非天然存在的核苷酸可以是已经改变(例如从A到G)的核苷酸，或可以 是被添加的非天然存在的核苷酸(例如一个G可被插入到序列中）。可设计将非天然存在的 核苷酸包含到天然序列中，从而生成发夹结构，换句话讲，可以工程改造天然序列以在将不 会天然存在发夹结构的位置促使形成发夹结构。可以通过在天然序列中改变或添加至少一 个非天然存在的核苷酸而将天然序列设计成包含偏向3'端的发夹结构，例如可在天然序列 中包含1、2、3、4、5、6或7个非天然存在的核苷酸以生成发夹结构。在某些实施方案中，非天 然存在的核苷酸可包含经修饰的核苷酸。
[0032]靶核酸和寡核苷酸 本说明书提供了通过扩增例如，靶核酸序列的一部分以检测靶核酸的SNP的方法，所述 靶核酸序列可以是已知或疑似包含一个或多个SNP的任何靶核酸序列，例如来自，例如， HIV、HCV