或对利福平(rifampicin)有抗性的MTB的靶核酸序列。为了检测靶核酸序列的SNP， 可以制备引物和探针以扩增该靶核酸序列。本领域技术人员还可以使用常规方法评价功能 性变体的特异性和/或灵敏度。代表性的功能性变体可包括，例如，本文中所公开的引物和/ 或探针中的一个或多个缺失、插入和/或取代。例如，可以提供基本上相同的引物或探针的 变体，其中所述变体与一个原始的引物和探针或其互补体具有至少，例如，80%、90%或95%的 序列同一性。
[0033] 可以识别出引物和/或探针中任一者的功能活性变体，相比相应的原始序列，其在 当前描述的方法、试剂盒或水解探针中提供了相似的或更高的特异性和灵敏度。
[0034] 如上文详述的，引物(和/或探针)可以经化学修饰，即，引物和/或探针可包含经修 饰的核苷酸或非核苷酸化合物。那么探针(或引物）即为经修饰的寡核苷酸。"经修饰的核苷 酸"（或"核苷酸类似物"）通过一些修饰而不同于天然"核苷酸"，但仍然由碱基或碱基样化 合物、戊咲喃糖(pentofuranosyl sugar)或戊咲喃糖样化合物、磷酸部分或磷酸样部分或 其组合组成。例如，"标记"可以被连接到"核苷酸"的碱基部分从而得到"经修饰的核苷酸"。 同样地，还可以用，例如，7-脱氮杂嘌呤替换"核苷酸"中的天然碱基从而得到"经修饰的核 苷酸"。术语"经修饰的核苷酸"或"核苷酸类似物"在本申请中可互换使用。"经修饰的核苷" (或"核苷类似物"）以如上文对于"经修饰的核苷酸"（或"核苷酸类似物"）所概括的方式，通 过一些修饰而不同于天然核苷。
[0035] 可以使用，例如，计算机程序如0LIG0(Molecular Biology Insights Inc ·， Cascade, Colo.)来设计扩增祀核酸序列的寡核苷酸(包括经修饰的寡核苷酸和寡核苷酸 类似物）。在设计待用作扩增引物的寡核苷酸时的重要特征包括但不限于适当大小的扩增 产物以方便检测(例如，通过电泳）、引物对的成员的相似的解链温度、以及每个引物的长度 (即，引物必须足够长得以具有序列特异性来退火并起始合成，但又不会过长使得在寡核苷 酸合成过程中保真度降低）。通常，寡核苷酸引物的长度为8至50、特别是10至40或12至40个 核苷酸（例如，长度为 8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、 48或50个核苷酸）。
[0036] 除了一组引物外，本方法还可使用一种或多种探针以检测靶核酸序列中SNP的存 在与否。术语"探针"指代合成或生物产生的核酸(DNA或RNA)，其经过设计或选择而含有特 定的核苷酸序列以使其能够在明确的预定严格性下与"靶核酸"特异性地（即，优先地）杂 交。"探针"可被称为"检测探针"，意味着其检测靶核酸。在本发明的一些实施方案中，所述 探针可以用至少一种荧光标记来标记。在一个实施方案中，探针可以用供体荧光部分（例 如，荧光染料)和对应的受体荧光部分(例如，猝灭剂)来标记。
[0037] 设计待用作TaqMan水解探针的寡核苷酸可以与设计引物类似的方式进行。本发明 的实施方案可使用单一探针来检测扩增产物。取决于实施方案，探针可包含至少一个标记 和/或至少一个猝灭剂部分。正如引物一样，探针通常具有相似的解链温度，并且每个探针 的长度必须足以进行序列特异性杂交，但又不能过长使得在合成过程中保真度降低。寡核 苷酸探针的长度通常为40个或更少的核苷酸，并且特别是12至40、15至40以及15至30(例 如，16、18、20、21、22、23、24 或 25)个核苷酸。
[0038] 聚合酶链式反应(PCR) 美国专利号 4,683,202、4,683，195、4,800，159和4,965，188公开了常规的？〇?技术。美 国专利号 5,210,015、5,487,972、5,804,375、5,804,375、6,214,979和7，141，377公开了实 时PCR和TaqMan ?技术。PCR通常采用两种寡核苷酸引物，其结合所选的核酸模板(例如，DNA 或RNA)。可用于所述实施方案的引物包括能够在靶核酸序列内部用作核酸合成起始点的寡 核苷酸。引物可通过常规方法从限制性酶切产物中纯化，或其可以经合成产生。就最大扩增 效率而言，引物优选地为单链的，但引物也可以是双链的。双链引物首先经过变性，g卩，处理 以使链分开。使双链核酸变性的一种方法是通过加热。
[0039]如果模板核酸是双链的，那么就有必要在其可被用作PCR中的模板之前将两条链 分开。链的分离可以通过任何合适的变性方法(包括物理、化学或酶促方法)而实现。分离核 酸链的一种方法涉及加热核酸直到其大部分变性(例如，大于50%、60%、70%、80%、90%或95% 变性）。使模板核酸变性所必要的加热条件将取决于，例如，缓冲液的盐浓度以及变性的核 酸的长度和核苷酸组成，但通常在约90 °C至约105 °C的范围内，而持续时间取决于反应的特 征（如温度和核酸长度）。变性通常进行约30秒至4分钟（例如，1分钟至2分30秒，或1.5分 钟）。如果双链模板核酸是通过加热变性，则使反应混合物冷却至一定的温度，该温度能在 靶核酸分子上促进每个引物退火至其靶序列。退火温度通常为约35°C至约65°C (例如，约40 °C至约60°C ;约45°C至约50°C )。退火时间可以为约10秒至约1分钟（例如，约20秒至约50秒； 约30秒至约40秒）。然后调节反应混合物至这样的温度，在该温度会促进或优化聚合酶活 性，即，该温度足以从经退火的引物进行延伸以生成与模板核酸互补的产物。该温度应当足 以从每个退火至核酸模板的引物合成延伸产物，但不应当过高而使延伸产物从其互补模板 变性(例如，用于延伸的温度通常在约40°C至约80°C的范围内（例如，约50°C至约70°C ;约 60 °C )。延伸时间可以为约10秒至约5分钟（例如，约30秒至约4分钟；约1分钟至约3分钟；约1 分30秒至约2分钟）。
[0040] PCR测定可采用靶核酸如RNA或DNA(cDNA)。模板核酸不必经过纯化;其可以是复杂 混合物的一小部分，如人细胞中含有的靶核酸。靶核酸分子可以通过常规技术如那些在 Diagnostic Molecular Microbiology:Principles and Applications (Persing 等人 (编撰），1993，American Society for Microbiology, Washington D.C.)中所述的常规 技术从生物样品中提取出来。核酸可得自多种来源，如质粒或天然来源(包括细菌、酵母、病 毒、细胞器)或高等生物(如植物或动物）。
[0041] 在诱导引物延伸的反应条件下，将寡核苷酸引物与PCR试剂组合。例如，链延伸反 应一般包含50 mM KC1、10 mM Tris-HCl(pH 8.3)、15 mM MgCl2、0.001%(w/v)明胶、0.5-1.0 yg经变性的模板DNA、50 pM每种寡核苷酸引物、2.5 U Taq聚合酶和10% DMS0)。反应 通常含有150至320 μΜ的各(^了？、(1013、(11113、(《^13或其一种或多种类似物。
[0042] 新合成的链形成双链分子，其可被用于反应的后续步骤中。链分离、退火和延伸的 步骤可根据需要而频繁重复以产生所需数量的对应于靶核酸分子的扩增产物。反应的限制 因素是存在于反应中的引物、热稳定酶和核苷三磷酸的量。优选地将循环步骤(即，变性、退 火和延伸)重复至少一次。就检测用途而言，循环步骤的次数将取决于，例如，样品的性质。 如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多的循环步骤以扩增靶序列，使之足够用于检 测。通常，循环步骤会重复至少约20次，但也可能重复多达40、60或甚至100次。
[0043] 荧光共振能量转移(FRET) FRET 技术（参见，例如，美国专利号 4,996，143、5,565，322、5,849,489和6,162,603)是 基于这样的概念：当供体荧光部分和对应的受体荧光部分被置于一定相互距离之内时，两 个荧光部分之间会发生能量转移，其可以被目测或另外检测和/或定量。当供体经适当波长 的光辐射激发时，供体通常向受体转移能量。受体通常将转移来的能量以不同波长的光辐 射的形式重新发射出去。
[0044]在一个实例中，寡核苷酸探针可含有供体荧光部分和对应的猝灭剂，所述猝灭剂 将转移来的能量以光以外的形式耗散掉。当探针完整时，能量转移通常发生在两个荧光部 分之间，这样使得来自供体荧光部分的荧光发射被猝灭。在聚合酶链式反应的延伸步骤期 间，结合至扩增产物的探针通过例如，Taq聚合酶的5 '至3 '核酸外切酶活性被切割，这样使 得供体荧光部分的荧光发射不再被猝灭。用于此目的的示例性探针在，例如，美国专利号5， 210,015、5,994,056和6,