一种蓝细菌脂肪烃合成关键基因及其应用_2

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段 ado-aar, WBamH I 和)(ho I 酶切祀Τ2化并回收载体部分,两者连接构建获得重组质粒ρΤΖ71。
[0039] 图17为重组载体ρΤΖ72的基本结构。WBamH I和Not I酶切ρΤΖ64并回收 Calot虹ix sp. NIES-2101的产姪基因片段ado-aar, W BamH I和Not I酶切祀Τ2化并回 收载体部分,两者连接构建获得重组质粒ρΤΖ72。
[0040] 图18为重组载体ρΤΖ73的基本结构。W BamH I和化0 I酶切ρΤΖ65并回收 S巧tonema sp. NIES-2130的产姪基因片段ado-aar, WBamH I和化〇 I酶切祀Τ2化并回 收载体部分,两者连接构建获得重组质粒PTZ73。
[0041] 图19为重组载体PTZ66的基本结构。W Nde I酶切PTZ60补平,再W化0 I酶切 并回收Nostoc calcicola FACHB 389的产姪基因片段ado-aar,克隆入经相同限制性内切 酶处理的PXX47中,构建获得重组质粒PTZ66。
[0042] 图20为基于GC-MS测定的产姪基因工程藍细菌ZT187的脂肪姪组成和特性。
[0043] 图21为基因工程藍细菌ZT187的脂肪姪产量分析。
[0044] 序列表信息:
[0045] 沈Q ID NO: 1为Nostoc calcicola FACHB 389的脂肪醒脱甲醜基加氧酶编码基因 ado的序列。
[0046] 沈Q ID NO: 2 为 Nostoc calcicola FACHB 389 的脂醜 ACP 还原酶编码基因 aar 的 序列。
[0047] SEQ ID N0:3为Leptolyngbya sp.NIES-30的脂肪醒脱甲醜基加氧酶编码基因 ado 的序列。
[0048] 沈Q ID N0:4为Leptolyngbya sp. NIES-30的脂醜ACP还原酶编码基因 aar的序 列。
[0049] 沈Q ID N0:5为化ormidium ambigimm NIES-2119的脂肪醒脱甲醜基加氧酶编码 基因 ado的序列。
[0050] SEQ ID N0:6 为Phormidium ambiguum NIES-2119 的脂醜ACP还原酶编码基因 aar 的序列。
[0051] 沈Q ID N0:7为Chroogloeo巧stis siderophila NIES-1031 的脂肪醒脱甲醜基加 氧酶编码基因 ado的序列。
[0052] 沈Q ID N0:8 为 Chroogloeo巧stis siderophila NIES-1031 的脂醜ACP 还原酶编 码基因 aar的序列。
[0053] 沈Q ID N0:9为Calot虹ix sp. NIES-2101的脂肪醒脱甲醜基加氧酶编码基因 ado 的序列。
[0054] 沈Q ID NO: 10为Calot虹ix sp. NIES-2101的脂醜ACP还原酶编码基因 aar的序 列。
[005引 569 10脈11为8巧扣116111曰3口.肌65-2130的脂肪醒脱甲醜基加氧酶编码基因曰(10 的序列。
[0056] SEQ ID NO: 12为S巧tonema sp. NIES-2130的脂醜ACP还原酶编码基因 aar的序 列。
[0057] 沈Q ID NO: 13为引物389F的核巧酸序列。
[0058] 沈Q ID NO: 14为引物389R的核巧酸序列。
[0059] SEQ ID NO: 15为引物30F的核巧酸序列。
[0060] 沈Q ID NO: 16为引物30R的核巧酸序列。
[006。 SEQ ID NO: 17为引物2119F的核巧酸序列。
[006引 SEQ ID NO: 18为引物2119R的核巧酸序列。
[0063] 沈Q ID NO: 19为引物1031F的核巧酸序列。
[0064] 沈Q ID N0:20为引物1031R的核巧酸序列。
[0065] 沈Q ID N0:21为引物2101F的核巧酸序列。
[006引 SEQ ID N0:22为引物2101R的核巧酸序列。
[0067] 沈Q ID N0:23为引物2130F的核巧酸序列。
[0068] 沈Q ID N0:24为引物2130R的核巧酸序列。
[0069] 沈Q ID N0:25 为 Nostoc calcicola FACHB 389 的 ado-aar 及其间隔序列。
[0070] 沈Q ID NO:26 为 Leptolyngbya sp. NIES-30 的 ado-aar 及其间隔序列。
[0071] SEQ ID NO:27 为 Phormidium ambiguum NIES-2119 的 ado-aar 及其间隔序列。
[0072] SEQ ID N0:28 为 C虹oogloeocystis sidero地ila NIES-1031 的及其间隔序列。
[0073] 沈Q ID N0:29 为 Calot虹ix sp. NIES-2101 的 ado-aar 及其间隔序列。
[0074] 沈Q ID NO:30 为 S巧tonema sp. NIES-2130 的 ado-aar 及其间隔序列。
[00巧]沈Q ID N0:31为Fischerella major NIES-592的脂醜ACP还原酶的氨基酸序列。
[0076] 沈Q ID NO:31为Nostoc calcicola FACHB 389的脂肪醒脱甲醜基加氧酶的氨基 酸序列。
[0077] 沈Q ID N0:32为Nostoc calcicola FACHB 389的脂醜ACP还原酶的氨基酸序列。
[0078] 沈Q ID NO: 33为Leptolyngbya sp.NIES-30的脂肪醒脱甲醜基加氧酶的氨基酸序 列。
[0079] 沈Q ID NO: 34为Leptolyngbya sp. NIES-30的脂醜ACP还原酶的氨基酸序列。
[0080] 沈Q ID N0:35为Phormidium ambiguum NIES-2119的脂肪醒脱甲醜基加氧酶的氨 基酸序列。
[0081] 沈Q ID N0:36 为Phormidium ambiguum NIES-2119 的脂醜ACP还原酶的氨基酸序 列。
[0082] 沈Q ID N0:37 为 Chroogloeo巧stis siderophila NIES-1031 的脂肪醒脱甲醜基 加氧酶的氨基酸序列。
[0083] 沈Q ID N0:38 为 Chroogloeo巧stis siderophila NIES-1031 的脂醜 ACP 还原酶 的氨基酸序列。
[0084] 沈Q ID N0:39为Calot虹ix sp. NIES-2101的脂肪醒脱甲醜基加氧酶的氨基酸序 列。
[0085] 沈Q ID N0:40为Calot虹ix sp. NIES-2101的脂醜ACP还原酶的氨基酸序列。
[0086] 沈Q ID N0:41为S巧tonema sp. NIES-2130的脂肪醒脱甲醜基加氧酶的氨基酸序 列。
[0087] 沈Q ID N0:42为S巧tonema sp. NIES-2130的脂醜ACP还原酶的氨基酸序列。
[008引 SEQ ID NO:43为引物ado-1的核巧酸序列。
[0089] SEQ ID NO: 44为引物ado-2的核巧酸序列。
[0090] 沈Q ID N0:45为引物aar-1的核巧酸序列。
[0091] 沈Q ID NO: 46为引物aar-2的核巧酸序列。
【具体实施方式】
[0092] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本文所述实施例是W说明 性而非限制性形式提供。本领域技术人员将会理解,可W改变或修改多个非关键参数而获 得相似性的结果。
[009引相关术语
[0094] 在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术 人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的藍细菌培养、分子生物学、分析化学实验操作 步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术 语的定义和解释。
[0095] 如本文所用,"藍细菌(切anobacterium)"是一类光合自养的原核微生物,其能够 利用太阳能,固定二氧化碳。藍细菌也称为藍藻。在本发明中,"藍细菌"和"藍藻"可互换 使用。
[0096] 如本文所用,"种质资源(Germplasm resources)"是一切具有一定种质或基因并 能繁殖的生物类型的总称。种质资源又称遗传资源。包括但不限于:古老的地方品种、新培 育的推广品种、重要的遗传材料、野生近缘植物,微生物等等。
[0097] 如本文所用,"脂肪姪"是具有脂肪族化合物基本属性的碳氨化合物。分子中碳原 子间连结成链状的碳架,两端张开而不成环的姪,叫做开链姪,简称链姪。因为脂肪具有送 种结构,所W也叫做脂链姪。有些环姪在性质上不同于芳香姪,而十分类似脂链姪,送类环 姪叫脂环姪。送样,脂肪姪便成为除芳香姪W外的所有姪的总称。
[0098] 如本文所用,"醜基载体蛋白(a巧1 carrier protein, ACP)"-般缩写为ACP。从 头合成脂肪酸,是在含有多种酶的复合体的脂肪酸合成系统的催化下进行的,而在它的醜 基缩合的阶段,醜基CoA不是作为直接底物,而是被转移至复合体中的醜基载体蛋白起反 应的。ACP在动物或酵母中不易从酶复合体解离出来,但在大肠杆菌则可被分离,分子量为 8847道尔顿,由77个氨基酸残基组成。4'-磯酸泛酸琉基己胺与蛋白质部分的丝氨酸W 脂键结合ACP的生成如下;辅酶A的4'-磯酸泛醜琉基己胺由酶的反应转移至脱辅基的 ACP。
[0099] 如本文所用,"脂醜ACP还原酶(Fatty ac}d-ACP reductase, AAR)"是藍细菌脂肪 姪合成途径中的一个关键酶,催化脂醜ACP转化为脂肪醒。编码藍细菌脂醜ACP还原酶的 基因是本领域公知的,包括但不限于;来源于藍细菌Fischerella major NIES-592,Nostoc calcicola FACHB 389,Leptolyngbya sp. NIES-30, Phormidium ambiguum NIES-2119, Chroogloeocystis siderophila NIES-1031, Calothrix sp. NIES-2101 和 Scytonema sp. NIES-2130的脂醜ACP还原酶。
[0100] 如本文所用,"脂肪醒脱甲醜基加氧酶(Fatty aldehyde deformylating oxygenase, ADO)"是藍细菌脂肪姪合成途径中的一个关键酶,催化脂肪醒转化为脂肪 姪,属于类铁蛋白
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