，扩增产物克隆入祀ASY Blunt载体（氨予/卡郝抗性），构建获得 重组质粒ρΤΖ64 (如图11所示）。
[013引 W 引物 2130-1/2(SEQ ID Ν0:23/24)扩增 S巧tonema sp. NIES-2130 的基因组 DM,获得1887bp的片段，扩增产物克隆入祀ASY Blunt载体（氨予/卡郝抗性），构建获得 重组质粒PTZ65 (如图12所示）。
[0137] 上述PCR均使用化stP化Fly DNA聚合酶，扩增条件如下：
[0138] 95°C,5min ；(95°C ,30sec,55°C ,30sec,72°C ,3min)30X ；72°C,l〇min
[0139] (3)大肠杆菌感受态制备及质粒的转化
[0140] 1)大肠杆菌感受态细胞
[0141] 大肠杆菌感受态细胞（Trans T1感受态）购自北京全式金生物技术有限公司
[0142] 2)重组质粒的转化
[0143] 取出一支-8(TC保存的感受态细胞，置于冰中融化5min。
[0144] 向融化的感受态细胞中分别加入上述步骤（2)获得5-10 μ 1不同扩增产物（如 SEQ ID NO:25至SEQ ID NO:30所示）与pEASY Blunt载体的连接液，轻轻混匀，冰水浴中 放置30min〇
[0145] 42°C热激90砂，然后立即冰水浴2min。
[0146] 加入900μ 1 LB液体培养基，37°C、200巧m震荡复苏1小时。
[0147] 500化pm离必3min，弃上清，沉淀重悬于100 μ 1 LB培养基中，涂布氨予（50 μ g/ 血)/卡郝巧0 μ g/血）双抗固体平板。
[014引将平板倒置于37°C的培养箱里培养12-16小时后长出菌落。
[0149] (4) W重组质粒 ρΤΖ60、ρΤΖ61、ρΤΖ62、ρΤΖ63、ρΤΖ64 和 ρΤΖ65 转化大肠杆菌 Trans T1感受态，即分别获得含有产姪基因的菌株ZT166、ZT167、ZT168、ZT169、ZT170和ZT171。
[0150] 实施例5 ;藍细菌产姪关键基因 ado-aar在大肠杆菌中的表达及产姪情况分析
[0151] (1) ado-aar表达载体的构建
[0152] W BamH I 和化〇 I 酶切 ρΤΖ60 并回收 Nostoc calcicola FACHB 389 的产姪基因 片段ado-aar, W BamH I和化0 I酶切祀T2化并回收载体部分，两者连接转化大肠杆菌感 受态细胞灯rans T1感受态），构建获得重组质粒PTZ68 (如图13所示）
[0153] W BamH I 和化〇 I 酶切 ρΤΖ61 并回收 Leptolyngbya sp. NIES-30 的产姪基因片 段ado-aar, W BamH I和化0 I酶切祀T2化并回收载体部分，两者连接转化大肠杆菌感受 态细胞CTrans T1感受态），构建获得重组质粒ρΤΖ69 (如图14所示）
[0154] W BamH I 和)(ho I 酶切 ρΤΖ62 并回收 F^hormidium ambiguum NIES-2119 的产姪 基因片段ado-aar, W BamH I和化0 I酶切祀T2化并回收载体部分，两者连接转化大肠杆 菌感受态细胞CTrans T1感受态），构建获得重组质粒ρΤΖ70 (如图15所示）
[0155] W BamH I 和)(ho I 酶切ρΤΖ63 并回收Qiroogloeo巧stis siderophila NIES-1031 的产姪基因片段ado-aar, W BamH I和化o I酶切祀T2化并回收载体部分，两者连接转化 大肠杆菌感受态细胞灯rans T1感受态），构建获得重组质粒PTZ71 (如图16所示）
[0156] W BamH I和Not I酶切ρΤΖ64并回收Calot虹ix sp. NIES-2101的产姪基因片段 ado-aar, WBamH I和Not I酶切祀T2化并回收载体部分，两者连接转化大肠杆菌感受态 细胞CTrans T1感受态），构建获得重组质粒ρΤΖ72(如图17所示）
[0157] WBamH I和化〇 I酶切ρΤΖ65并回收Sc5rtonema sp. NIES-2130的产姪基因片段 ado-aar, WBamH I和化0 I酶切祀T2化并回收载体部分，两者连接转化大肠杆菌感受态 细胞（Trans T1感受态），构建获得重组质粒ρΤΖ73 (如图18所示）
[015引 （2) ado-aar在大肠杆菌中的表达
[0159] 宿主菌；大肠杆菌化祀为脂醜CoA脱氨酶的编码基因，fa祀的敲除可使细胞积累 脂醜CoA，有利于脂肪酸衍生物（例如脂肪酸己醋、脂肪醇）的生成值uan et al. 2011)。因 此，本发明ado-aar功能验证的相关实验选择W化21 0E3) 化祀突变株作为宿主细胞。 W重组质粒 ρΤΖ68、ρΤΖ69、ρΤΖ70、ρΤΖ71、ρΤΖ72 和 ρΤΖ73 转化化21 (DE3) Δ fa祀突变株， 即分别获得基因工程产姪大肠杆菌菌株ZT181、ZT182、ZT183、ZT184、ZT185和ZT186。
[0160] 培养基：所用培养基为适合重组菌产姪的改良M9培养基，其具有如下成分；6g/L 胞2册〇4, 3g/L KH2PO4, 0. 5g/L 化Cl, 2g/L NH4CI，0. 25g/L Μ拆〇4 · 7电0, llmg/L CaClz，27mg/ L 化CI3 · 6电〇, 2mg/L aiClz · 4&〇, 2mg/L 化2M0O4 . 2&0, 1. 9mg/L CuS〇4 · 5&〇, 0. 5mg/L H3BO3, Img/L thiamine, 200mM Bis-Tris(pH 7. 和 0. 1% (v/v)Triton-X100〇
[0161] 诱导及培养；将所构建的ZT181、ZT182、ZT183、ZT184、ZT185和ZT186菌株分别在 接种于5mL液体改良M9培养基中（含50 μ g/血氨予青霉素），3(TC，250巧m培养12h，而后 按1:50 (v/v)接种比例培养液转接至20mL改良M9培养基中（含50 μ g/mL氨予青霉素）， 培养至对数期（ODe。。约为0. 6~0. 8)后，加入0. 5mM IPTG诱导剂，30°C，250巧m培养2地， 所得菌液用于脂肪姪提取。
[0162] (3)基因工程大肠杆菌脂肪姪提取及产量分析
[016引取10血处于平台期的上述各产姪基因工程大肠杆菌到20血小烧杯中，置于冰 水浴上，超声波破碎lOmin (10s on, 10s off)。破碎后分别加入50 μ g正二十焼姪作为内 标，混匀后加入10血氯仿：甲醇（V:V为2 ;1)，剧烈震荡混匀1-2小时后。然后6, OOOg离 必lOmin，将下层有机相转移至新的试管中，置55°C下氮气吹干。加入100 μ L正己焼溶 解所提脂肪姪，然后经0. 22 μ m滤膜过滤，转移至2ml气相小瓶中（内置200 μ L衬管）。 采用Agi 1 ent 7890Α气相色谱-质谱联用仪（GC-M巧测定脂肪姪，GC-MS测试程序为： 40°C Imin ; W 5°C /min 升至 20(TC ; W 25°C /min 至 240°C ;240°C维持 15min。色谱柱为 HP-I順0Wax(30mX250μmX0.25μm);载气是氮气，气体流速为lmL/min，进样量为lμL， 进样口温度为25(TC。各菌株脂肪姪组成及脂肪姪总产量总结于表3中。
[0164] 表3.基因工程大肠杆菌产姪情况分析
[0165]
[0166] 上述结果证实本发明所公开的来源于Nostoc calcicola FACHB 389， Leptolyngbya sp.NIES-30, Phormidium ambiguum NIES-2119, Chroogloeocystis siderophila NIES-1031，Calot虹ix sp. NIES-2101 或 Scytonema sp. NIES-2130 的 aar 和 ado基因序列在大肠杆菌中均可W正常表达，使不能产姪的大肠杆菌获得脂肪姪合成能力。
[0167] 实施例6 ;Nostoc calcicola FACHB 389脂肪姪合成关键基因在模式藍细菌 Synechocystis sp. PCC 6803的表达及产姪情况分析
[0168] (Dado-aar表达载体的构建
[0169] WNde I 酶切 ρΤΖ60 补平，再^化〇 I 酶切并回收 Nostoc calcicola FACHB 389 的产姪基因片段ado-aar，克隆入经相同限制性内切酶处理的pXX47 (例如参见中国发明专 利申请201310595856. 3)(提供藍细菌基因组中性位点整合平台、抗性筛选标记及强启动 子）中，构建获得重组质粒PTZ66。
[0170] (2)ad〇-aa;r在藍细菌中的表达
[0171] 宿主菌；Synecho巧stis sp. PCC 6803，W 重组质粒 ρΤΖ66 转化 Synechocystis sp. PCC 6803获得基因工程产姪藍细菌ZT187 (壮观霉素抗性）。
[0172] 培养基：藍细菌培养所用培养基为BG11培养基，其具有如下成分；1.5g L iNaN〇3, 40mg L 屯册〇4 ·抓2〇, 36mg L iCaClz · 2&0, 6mg L 1 巧樣酸，6mg L 1 巧樣酸铁 倭，Img L 1 邸ΤΑ 二钢盐，2〇mg L 1 化C〇3, 2. gmg L 1&8〇3, 1. Smg L iMnClz · 4&〇, 0. 2加邑 L iZnS〇4 · 7&0, 0. 39mg L iNaMo〇4 · 2&0, 0. 079mg L iCuS〇4 · 5&0 和 0.0 lmg L iCoClz · 6&0。 固体培养基中补加 8mM TES缓冲剂，0. 3% NazSzOs和1. 5%琼脂粉。
[0173] 转化方法；取处于对数生长期（0〇73。约为0. 5~1. 0)的Synechocystis sp. PCC 6803野生型细胞5mU离必收集细胞；用新鲜的BGll培养基洗涂细胞两次，再将细胞重悬 于0. 5mLBGl 1培养基中。取0. 2mL细胞重悬液置于新的PCR管中，加入2~3中，重组质粒 PTZ66,混匀，置于3(TC、30 μ 0, 2s 1光照条件下温育4小时。然后将混合物涂布于铺在BG11 平板上的硝酸纤维素膜上，并置于3(TC、30的硝酸纤2s 1光照条件下培养24小时。然后， 将硝酸纤维素膜转移到壮观抗性的固体平板上，在3(TC、30性后，将2s 1的光照条件下继续 培养5~7天，将转化子从平板上挑出，在新鲜的BG11平板（壮观抗性）上划线培养5~ 7天；最后接入壮观抗性液体BG11培养基培养，提取基因组，PCR验证基因