ing and DNA analysis:an introduction.Cambridge,MA：BlackwelI Pub.ISBNl-4051-1121-6。
[0131] 实施例13:昆虫鱼尼下受体基因转染
[0132] 将含有相关基因的质粒DNA和试剂（Invitrogen)-起混合在SF900II(SFM，G化CO) 中，并用新鲜传代的昆虫细胞进行培养。典型的条件如下:S巧细胞密度为1.OXicr 6/mL，细 胞体积IOml的（悬浮细胞），IOiig质粒，30mL试剂，培养时间为30分钟，瞬时表达时间为48-72 小时。将下列试剂一起加入1.5mL微离屯、管中制备转染混合物：1ml SF900II(SFM，Gibco)， IOyg pIB/V5-His 质粒（在 TE 缓冲液中，IOmM Tris-CiamM EDTA，lygAiL，抑 8.0)和 30化试 剂（Invitrogen)(使用前揽拌均匀，之后一直添加）。轻轻揽拌转染混合物10秒，在室溫下培 养30分钟。在SF900II(SFM，Gibco)中，用Biocolor 化ina摇床，在IlOrpm下，在27°C，培育 S巧细胞(大于95%的存活率的对数期细胞）。将IOmL S巧细胞Wl X IO6个细胞/ml的浓度接 种在50ml体积的摇瓶中。将整个转染混合物加入到IOmL S巧细胞中，并在摇床中，在11化pm 下，在27°C培养48-72小时，然后收获。转染后的细胞用阳性化合物氯虫酷胺和氯虫苯甲酯 胺测试证实转染成功。表2列出测试结果，测试方法见实施例23。文献：
[0133] George P丄ahm，等Rynaxypyre:
[0134] A new insecticidal anthranilic diamide that acts as a potent and selective ryanodine receptor activator,Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 17(2007)6274-6279。
[013己] George P.Lahm,Daniel Cordova，James D.Barry，
[0136] New and selective ryanodine receptor activators for insect control
[0137] Biooi^ganicSMedicinal Qiemistryl7(2009)4127-4133D
[0138] 实施例14:用Sf9细胞进行钩转移试验（Calcium MobilizationAssay) W检测化合 物对激活鱼尼了受体的活性：此活性被证明是和化合物杀虫效果相关的，参见George P. Lahm，等民 ynaxypyre:
[0139] A new insecticidal anthranilic diamide that acts as a potent and selective ryanodine receptor activator，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 17(2〇〇7)6274-6279。66〇巧0 P.Lahm，Daniel Cordova，James D.Bariy，
[0140] New and selective ryanodine receptor activators for insect control
[0141] Bioo巧anic&Medicinal Chemistryl7(2009)4127-4133。将野生型和转染Sf9细胞 稀释到1.4X106个细胞/ml并且悬浮液在室温用在SF-900SFM培养基中的Flu〇-4AM(2tiM)负 载45分钟。负载后，将细胞^1000巧111离屯、2分钟，再悬浮于新鲜的培养基中去除染料，重复 离屯、过程。然后将细胞重新悬浮在生理盐水中。染料负载的细胞（1.4X IO5个细胞/孔)接种 到96孔板(Corning ,3603)，并在Flexstation板读数器的测试前，使其着色30分钟。向孔中 加入制备于生理盐水中的试验化合物。监测在485nm激发、在525nm发射的焚光。每个数据点 用2个样品，计算每个化合物激活鱼尼下受体的活性化Cso)数值。表3列出了在激活慶虫鱼尼 下受体的过程中，与漠氯虫酷胺和氯虫苯甲酯胺相对比，利用昆虫鱼尼下受体转染Sf9细胞 系测定的一些本发明化合物的鱼尼下受体激动剂活性化Cso值）。
[0142] 实施例15:表达鱼尼下受体的昆虫和哺乳动物细胞系的制备：
[0143] 哺乳动物细胞系中鱼尼下受体激动剂活性表示化合物对哺乳动物和人类的潜在 效果，并可W被用作化合物的潜在毒性作用的指示。可W使用合适的表达鱼尼下受体的哺 乳动物细胞来测试化合物W评估它们对哺乳动物的鱼尼下受体的活性和相对昆虫细胞系 的选择性。参见Ebbin邑haus-Kintscher，U.，Flubendiamide，the first insecticide with a novel mode of action on insect ryanodine receptors,PfIanzenschutz-Nachrichten Bayer60/2007,2117-140。从Invitrogen Life I'echnologies获取Sf9细胞系 和Sf-900II SFM培养基。在摇瓶中，Sf-900IISFM培养基上，27°C下生长野生型和转染Sf9细 胞。从美国典型培养物保藏中屯、(ATCC)获取PC-12细胞系（大鼠嗜铭细胞瘤细胞系)并使其 在ATCC配制的RPMI-1640培养基中生长。通过向基础培养基添加热灭活的马血清至终浓度 10%，添加胎牛血清至终浓度为5 %，W制造生长培养基。将细胞在37°C，5%C〇2下培育。从 ATCC获取C2C12细胞系（小鼠成肌细胞系），并使其在ATCC配制的Dulbeccc/S Modified Eagle'S培养基中生长。向基础培养基中添加牛胎儿血清到至终浓度为10%制备生长培养 基。在37°C，5%C02下培育细胞。从ATCC获取IMR-32细胞系（人神经母细胞瘤细胞系），并使 其在ATCC配制的化gle'sMinimum Essential培养基中生长。向基础培养基中添加牛胎儿血 清到终浓度为10 % W制备生长培养基。于37°C，5 % C〇2下培育细胞。
[0144] 实施例16:用C2C12与IMR32细胞系进行巧转移试验：
[0145] 在实验前一天，W30000个细胞/100化的密度将C2C12和IMR32细胞铺于有透明底 板的96孔黑色壁上，然后在5%C02,37°C培养箱中培养过夜。测定之前细胞单层达到80-90%汇合。去除培养基，并且用含Flu〇-4AM(2iiM)的皿SS缓冲液在37°C下负载细胞45分钟。 负载后，用皿SS缓冲液将细胞洗涂两次。然后用Flexstation板读数器进行巧转移试验。向 孔中加入制备于皿SS中的试验化合物，浓度为OuM, luM，lOuM，lOOuM，ImM。监测在485nm激 发、在525nm发射的巧光。计算每个化合物激活巧转移的活性数值。
[0146] 实施例17:用PC12细胞系进行巧转移试验：
[0147] PC12细胞是悬浮液细胞，将细胞稀释到1.0 X IO6个细胞/ml,并且悬浮液在37 °C 下，用在皿SS缓冲液中的Flu〇-4AM( 2山〇负载45分钟。负载后，将细胞W100化pm离屯、2分钟， 再悬浮于皿SS缓冲液中W去除染料，重复离屯、过程。然后将细胞重新悬浮在皿SS中。将染料 负载的细胞（1 .OX IO5个细胞/孔)接种到96孔板(Corning,3603)，并在Flexstation板读数 器的测试前，使其着色30分钟。向孔中加入制备于皿SS中的试验化合物，浓度为0uM、luM、 10碰、100碰、111^。监测在485醒激发的在525皿发射的巧光，计算每个化合物激活巧转移的 活性数值。
[0148] 表4列出了与漠氯虫酷胺和氯虫苯甲酯胺相比，本发明部分化合物激活哺乳动物 细胞巧转移的活性，包括PC-12细胞(大鼠嗜铭细胞瘤细胞）、C2C12细胞(小鼠成肌细胞）， IMR-32细胞(人神经母细胞瘤细胞）。
[0149] 实施例18:本发明的邻甲酯氨基苯甲酯胺衍生物I的杀虫、杀蛾活性测定结果。利 用溫室昆虫和昆虫幼虫进行杀虫性测量。本发明的化合物的杀虫、杀蛾活性的评价是通过 溫室杀虫实验进行的，表5列出了化合物的杀虫杀蛾结果。表5可见:本发明的部分邻甲酯氨 基苯甲酯胺衍生物对粘虫的杀虫活性测定结果见上表，数据表明，在I微克/毫升时，本发明 的I-1、I-3、I-4、I-7、I-10、I-12、I-15、均表现出了优异的杀粘虫活性，在给药48小时后，死 亡率均达到85% W上，明显高于阳性对照药剂氯虫酷胺的活性。其他化合物对粘虫的杀虫 活性也在60% W上。同时测定了相橘红蜘蛛的活性，结果见表5,在1微克/毫升时，对相橘 红蜘蛛的杀蛾活性结果表明，本发明的I -1、I -2、I -4、I -7、I -9、I -10、I均表现出了优异的杀 红蜘蛛活性，在给药48小时后，死亡率均达到85% W上，明显高于阳性对照药剂氯虫酷胺的 活性。其他化合物对相橘红蜘蛛的杀虫活性也在60 % W上。
[0150] 本发明的部分邻甲酯氨基苯甲酯胺衍生物对小菜蛾的杀虫活性测定结果见表5， 数据表明，在1微克/毫升时，本发明的I-l、I-5、I-8、I-9、I-17、I-18、I-25、I-30、均表现出 了优异的杀小菜蛾活性，在给药48小时后，死亡率均达到85% W上，明显高于阳性对照药剂 氯虫酷胺的活性。其他各化合物对小菜蛾的杀虫活性也在60% W上。
[0151] 同时做了对蛇蜡的活性测定，结果见表5,在1微克/毫升时，对蛇蜡的杀虫活性结 果表明，本发明的1-2、1-5、1-9、1-17、1-18、1-25、1-30、均表现出了优异的杀蛇蜡活性，在 给药48小时后，死亡率均达到85% W上，明显高于阳性对照药剂氯虫酷胺的活性。其他各化 合物对蛇蜡的杀虫活性也在60% W上。因此，本发明的化合物的有较好的杀虫、杀蛾活性。
[0152] 实施例19:本发明的邻甲酯氨基苯甲酯胺衍生物I的杀菌活性测定：
[0153] 本发明的邻甲酯氨基苯甲酯胺衍生物I杀菌或抑菌活性采用菌体生长率测定法， 具体过程是:取5毫克样品溶解在适量二甲基甲酯胺内，然后用含有一定量吐溫20乳化剂水 溶液稀释至500微克/毫升的药剂，将供试药剂在无菌条件下各吸取1毫升注入培养皿内，再 分别加入9毫升培养基，摇匀后制成50微克/毫升含药平板，W添加1毫升灭菌水的平板做空 白对照，用直径4毫米的打孔器沿菌丝外缘切取菌盘，移至含药平板上，呈等边=角形摆放， 每处理重复3次，将培养皿放在24±1摄氏度恒溫培养箱内培养，待对照菌落直径扩展到2-3 厘米后调查各处理菌盘扩展直径，求平均值，与空白对照比较计算相对抑菌率，供试菌种包 括多种代表在我国农业生产中田间实际发生的大部分植物病原菌的种属，其名称和代号包 括AS:番茄早疫病菌（Alternaria solani)、BC:黄瓜灰霉病菌（Botiytis cinerea)、CA:花 生褐斑病菌（Cercospora arachidicola)、
[0154] GZ:小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)、PI:马铃馨晚疫病菌
[01 巧](Phyto地thora infes1:ans(Mont. )de Bary)、PP:苹果轮纹病菌
[0156] (Physalospora piricolaKPS:水稻纹枯病菌（Pellicularia sasakii)、RC:禾谷 丝核菌（I^iizoctonia cerealis)、SS:油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum)。菌体 生长率法测定结果见表6,表6表明，在50微克/毫升时，本发明合成的所有化合物均有不同 程度的杀菌活性，I-I对GZ、AS菌的杀菌活性高于40 % ; 1-2对PI、AS菌的杀菌活性高于40 % ; 1-3对GZ菌的杀菌活性高于40% ; 1-6对AS菌的杀菌活性高于40% ; 1-10对GZ、PI菌的杀菌活 性高于40% ; 1-13对PI菌的杀菌活性高于40% ; 1-16对GZ菌的杀菌活性高于40% ; 1-20对 GZ、PI菌的杀菌活性高于40% ;1-23对SS、RC菌的杀菌活性高于40%;1-29对?5、62、？1、八5、 SS、RC菌的杀菌活性高于40%。
[0157] 实施例20:本发明的邻甲酯氨基苯甲酯胺衍生物I与杀虫剂组合防治农业和林业 W及园艺植物虫害中的应用
[0158] 本发明的所有邻甲酯氨基苯甲酯胺衍生物I与现有的杀虫剂:毒死婢、地亚峡、晚 虫脉、甲氨基阿维菌素、弥拜菌素、阿维菌素、多杀菌素、氯戊菊醋、高效氯戊菊醋、氯氯菊 醋、高效氯氯菊醋、=氣氯氯菊醋、漠氯菊醋、甲氯菊醋、Beta-氣氯氯菊醋、氣氯氯菊醋、 Lambda-S氣氯氯菊醋、二氯苯酸菊醋、节氯菊醋、丙締菊醋、功夫菊醋、联苯菊醋、氯菊醋、 酸菊醋、氣氯苯菊醋、氯氣胺氯戊菊醋、化虫嘟、晚虫脉、締晚虫胺、氯嚷嘟、嚷虫嘟、嚷虫嗦、 嚷虫胺、巧虫胺、可尼下、达特南、除虫脈、灭幼脈、伏虫隆、除虫隆、氣铃脈、氣虫脈、晚虫隆、 風蛾脈、毒虫脈、氣幼脈、Novif Iumuron即多氣脈，其CAS号为121451-02-3、氣蛾脈、 Novaluron即双苯氣脈、氣晚脈、Bay sir6874即{1-[ (3.5-二氯-4)4-硝基苯氧基苯基3-3-(2-氯苯）-脈}、Bay SIR-8514即[l-(4-S氣甲氧基苯基）-3-(2-氯苯）-脈]、嗦虫脈、 Bistrif Iuron即双S氣虫脈、巧喃虫酷阱、虫酷阱、氯虫酷阱、甲氧虫酷阱、环虫酷阱、乐果、 氧化乐果、敌敌畏、乙酷甲胺憐、=挫憐、哇硫憐、化嗦硫憐、氯挫憐、叶赠散、西维因、抗晒 威、速灭威、异丙威、杀惧丹、仲下威、叶飞散、甲糞威、丙硫克百威、下硫克百威、杀惧丹、漠 蛾醋、嚷蛾酬、挫蛾醋、化蛾酬、四蛾嗦、烘蛾特、下酸脈、丙硫克百威、化晒酬、螺蛾醋、螺虫 醋、螺虫乙醋、下締氣虫腊、=挫锡、嚷嗦酬、灭线憐、氣虫腊、杀虫单、杀虫双、氯虫酷胺、氣 虫酷胺、氣氯虫酷胺、氯虫酷胺、挫虫酷胺、化蛾胺、漠虫腊、化嗦酬、乙蛾挫、化蛾胺、化幼 酬、化丙酸、埃玛菌素等中的任意一种或两种组合使用用于防治农业和林业W及园艺植物 虫害;本发明的邻甲酯氨基苯甲酯胺衍生物I在组合物中的质量百分含量是1%-90%，本 发明的邻甲酯氨基苯甲酯胺衍生物I与上述杀虫剂的比例为质量百分比1% :99%到99%; 1%;可直接兑水后喷雾，组合物的制剂中包含农业上可W接受的溶剂和乳化剂W及助溶剂 和增效剂等，组合物加工的剂型选自缓释剂、粉剂、微胶囊悬浮剂、可分散液体制剂、可分散 固体制剂、种子处理乳剂、水乳剂、颗粒剂、微乳剂、油剂、用农药包衣的种子、悬乳剂、可溶 性浓剂、毒谷、气雾剂、块状毒巧、缓释块、浓毒巧、胶囊悬浮剂、可分散浓剂、乳油、静电喷雾 剂、油包水乳剂、种子处理剂、水包油乳剂、烟雾罐、细粒剂、烟雾烛、烟雾筒、烟雾棒、烟雾 片、烟雾剂、烟雾丸、粒状毒巧、发气剂、油膏、热雾剂、固/液混合装剂、液/液混合装剂、冷雾 剂、固/固混合装剂、药漆、种子处理液剂、微粒剂、油悬剂、油剂、油分散性粉剂、膏剂、片状 毒巧、浓胶剂、泼诱剂、棒剂、种衣剂、毒巧、涂抹剂、小块毒巧、悬浮剂、悬浮乳剂、水溶性粒 剂、可溶性浓剂、成膜油剂、片剂、追踪粉剂、超低容量液剂、蒸汽释放剂中的任意一种;可W 防治的虫害主要有红蜘蛛、东亚飞幢、云斑车幢、中华稻幢、日本黄脊幢、单刺峻姑、东方峻 姑、稻劑马、烟劑马、溫室劑马、稻管劑马、麦简管劑马、溫室白粉風、烟粉風、黑尾叶赠、大青 叶赠、棉叶赠、斑衣蜡赠、褐飞風、白背飞風、灰飞風、甘薦扁角飞風、棉晒、麦二叉晒、麦长管 晒、桃晒、高梁晒、萝h晒、吹绵阶、桑盾阶、矢尖盾阶、梨圆阶、白蜡虫、红蜡阶、朝鲜球坚阶、 梨网睹、香蕉网睹、细角花睹、微小花睹、针缘睹、稻蛛缘睹、稻褐睹、稻黑睹、稻绿睹、绿盲 睹、首猜盲睹、中黑盲睹、大草略、丽草略、中华草略、谷蛾、衣蛾、黄刺蛾、褐刺蛾、扁刺蛾、麦 蛾、棉红铃虫、甘馨麦蛾、小菜蛾、桃小食屯、虫、大豆食屯、虫、桃小食屯、虫、苹果顶梢卷叶蛾、 褐带长卷叶蛾、拟小黄卷叶蛾、二化惧、豆芙惧、玉米惧、=化惧、菜惧、稻纵卷叶惧、条惧、棉 卷叶野惧、桃蛙惧、黏虫、斜纹夜蛾、稻惧略、棉小造桥虫、甜菜夜蛾、大惧、棉铃虫、鼎点金刚 钻、小地老虎、大地老虎、黄地老虎、盗毒蛾、舞毒蛾、甘馨天蛾、豆天蛾、直纹稻弄蝶、隐纹谷 弄蝶、相橘凤蝶、玉带凤蝶、菜粉蝶、巧麻赤峡蝶、巧麻黄峡蝶、豆完菁、金星步甲、皱銷步甲、 麦穗步甲、沟金针虫、细胸金针虫、谷斑皮蠢、黑皮蠢、相橘小吉下虫、金缘吉下虫、黄粉虫、 黑粉虫、赤拟谷盗、杂拟谷盗、铜绿异丽金龟、暗黑金龟、华北大黑觸金龟、桑天牛、星天牛、 橘褐天牛、桃红颈天牛、大猿叶虫、小猿叶虫、黄守瓜、黄曲条跳甲、绿豆象、魏豆象、蚕豆象、 玉米象、米象、小麦叶蜂、梨实蜂、黄带姬蜂、黏虫白星姬蜂、惧略悬虽姬蜂、棉铃虫齿唇姬 蜂、惧黑点痛姬蜂、蚊、蛹、化、麦红吸浆虫、麦黄吸浆虫、稻瘦蚊、相橘大实蛹、瓜实蛹、麦叶 灰潜蛹、美洲斑潜蛹、豆杆黑潜蛹、麦杆蛹、种蛹、葱蛹、萝h蛹、伞裙追寄蛹、玉米惧厉寄蛹、 黏虫缺须寄蛹等农业害虫、林业害虫；防治农业和林业W及园艺植物虫害中的植物包括稻 谷、小麦、大麦、燕麦、玉米、高梁、甘馨、马铃馨、木馨、大豆、荷兰豆、蚕豆、魏豆、绿豆、小豆、 棉花、蚕桑、花生、油菜、芝麻、向日葵、甜菜、甘薦、咖啡、可可、人参、贝母、橡胶、挪子、油栋、 剑麻、烟草、番茄、辣椒、萝h、黄瓜、白菜、芹菜、棒菜、甜菜、油菜、葱、大蒜、西瓜、甜瓜、哈密 瓜、木瓜、果、茶、