专利名称：锌荧光探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及特异性捕集锌离子并发出荧光的锌荧光探针。
背景技术：
锌在人体内是仅次于铁含量多的必须金属元素，细胞内大部分的锌离子和蛋白质牢固地结合，与蛋白质的结构保持和机能表现有关。另外，对于细胞内极其微量存在的游离锌离子(通常是μM水平以下)的生理作用，也有种种的报导。特别是，一般认为锌离子和细胞死因之一的细胞程序死亡有很深的关系，也有阿尔兹海默病促进老人斑形成等报导。
以往，为了测定组织内的锌离子，特异性捕集锌离子并形成络合物，使用随着络合物的形成而发出荧光的化合物(锌荧光探针)。作为锌荧光探针，例如已经实用化的TSQ(Reyes，J.G.等人，Biol.Res.，27，49，1994)、Zinquin乙酯(Tsuda，M.等人，Neurosci.，17，6678，1997)、丹磺酰基氨基乙基环楞胺(Koike，T等人，J.Am.Chem.Soc.，118，12686，1996)、Newport Green(作为Molecular Probe公司的商品目录的“Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals”第6版，Richard P.haugland pp.531-540)等。 但是，使用TSQ、Zinquin或者丹磺酰基氨基乙基环楞胺的测定由于需要使用短波长范围的激发光(激发波长分别是367nm、368nm和323nm)，在将这些锌荧光探针用于生物体系统的测定时，由短波长产生的激发可能引起细胞伤害(细胞工学，17，pp.584-595，1998)，另外，测定时，细胞系统自体易于受到具有的自体荧光(NADH和黄素类发出的荧光)产生的影响这样的问题。而且，丹磺酰氨基乙基环楞胺在测定时具有由于试剂存在的环境的差别，即溶剂的种类或者在细胞外、细胞内或者细胞膜等中的水溶性、脂溶性等的环境的差别，而使荧光强度发生很大变化这样的缺点(蛋白质·核酸·酶·增刊号，42，pp.171-176，1997)，TSQ也具有由于脂溶性高而使细胞全体均匀分布困难这样的问题。Newport Green虽然可以用长波长激发光进行测定，但是具有和锌离子的亲和性低，不具有实用的测定灵敏度这样的问题。因而，一直在谋求开发不会引起细胞障碍且可以高灵敏度测定锌离子的锌荧光探针。
发明公开本发明的课题在于提供可以作为高灵敏度的锌荧光探针而加以利用的化合物或者其盐。更具体地说，本发明的课题是提供一种化合物，该化合物可以特异性捕集锌离子，捕集后络合物的荧光强度优良，可以作为能够用长波长激发光测定的锌荧光探针而加以利用。再者，本发明另外的课题在于提供含有具有上述特征的化合物的锌荧光探针以及使用该锌荧光探针的锌离子的测定方法。
本发明者们为了解决上述课题，进行了锐意研究，结果发现了以环状胺或者聚胺为取代基的化合物对于锌离子具有高的特异性，捕集锌离子，形成用长波长范围内的激发光发出强的荧光的络合物(特愿平11-40325)。本发明者们进一步反复研究，发现了用下述通式(I)表示的化合物极其迅速地形成和锌的络合物，发出强的荧光。还发现了如果用下述通式(I)表示的化合物作为锌荧光探针，则和生物体内的锌离子即刻反应，由于形成荧光性的络合物，可以极其正确且高灵敏度地测定生物体内的锌。基于这些知识，完成了本发明。
即，本发明提供了用下述通式(IA)或(IB)表示的化合物或其盐 [式中，R1和R2分别独立地表示氢原子或者用下述式(A)表示的基团 (式中，X1、X2、X3和X4分别独立地表示氢原子、烷基、2-吡啶甲基或者氨基的保护基，m和n分别独立地表示0或1)，R1和R2不能同时是氢原子；R3和R4分别独立地表示氢原子或者卤原子；R5和R6分别独立地表示氢原子、烷基羰基或者烷基羰基氧基甲基，R7表示氢原子或者烷基]。
作为上述发明优选的方式，提供用下述通式(II)表示的化合物或其盐 (式中，R13和R14分别独立地表示氢原子或卤原子；R17表示氢原子或烷基；R18表示氢原子或氨基的保护基)。根据本发明优选的方式，可以提供R17和R18是氢原子的上述化合物或其盐，根据更优选的方式，可以提供对于用-COOR17表示的基团，苯环上的取代氨基结合到间位或对位上的化合物或其盐。
另外，根据本发明，可以提供用下述通式(IIIA)或(IIIB)表示的化合物或其盐 [式中，R21和R22分别独立地表示氢原子或用下述式(B)表示的基团， (式中，X11、X12、X13和X14分别独立地表示氢原子、烷基、2-吡啶基甲基或者氨基的保护基，p和q分别独立地表示0或1)，R21和R22不能同时是氢原子；Y表示-CO-NH或-NH-CO-；R23和R24分别独立地表示氢原子或卤原子；R25和R26分别独立地表示氢原子、烷基羰基或者烷基羰基氧基甲基；R27表示氢原子或烷基]。根据本发明优选的方式，可以提供对于用-COOR27表示的基团(形成内酯环时对应的羰基)，苯环上的Y结合到间位上的化合物。
从另外的观点来看，根据本发明，可以提供含有用上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是引入氨基的保护基的化合物除外)或者含有这些化合物的盐的锌荧光探针；以及由上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是引入氨基的保护基的化合物除外)或者这些化合物的盐和锌离子形成的锌络合物。该锌荧光探针可以用于测定组织和细胞内的锌离子。
从进一步的观点来看，根据本发明，可既提供了锌离子的测定方法，也提供了将用上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是引入氨基的保护基的化合物除外)或者这些化合物的盐用作锌荧光探针的方法；锌离子的测定方法，其特征在于包含以下工序(a)使上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是引入氨基的保护基的化合物除外)或者这些化合物的盐和锌离子反应的工序，以及(b)测定在上述工序中生成的锌络合物的荧光强度的工序；并且将上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是引入氨基的保护基的化合物除外)或者这些化合物的盐用作锌荧光探针。
用上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是只限于引入氨基的保护基的化合物)作为用于制造上述锌荧光探针的中间体是有用的。
图面的简单说明
图1表示本发明的锌荧光探针(化合物6)对于锌离子具有优良的选择性。
图2表示本发明的锌荧光探针(化合物12)对于锌离子具有优良的选择性。
图3表示本发明的锌荧光探针(化合物21)对于锌离子具有优良的选择性。
图4表示将本发明的锌荧光探针(化合物6和化合物12)的荧光强度的时间变化和具有环状聚胺部分的ACF-1进行比较的结果。
图5表示本发明的锌荧光探针(化合物6和化合物12)的荧光强度和锌离子浓度的关系。
图6表示化合物12以及化合物21和它们的锌络合物的荧光强度的变化对于pH的变化。
图7表示使用大鼠的海马切片来研究由缺血刺激产生的荧光强度的变化的结果。
图8表示使用大鼠的海马切片来研究在不同区域由缺血刺激产生的荧光强度的变化的结果。
实施发明的最佳方式将日本国专利申请的2000-50869号说明书公开的全部作为参考，包含在本说明书的公开中。
在本说明书中，“烷基”或者含有烷基部分的取代基(例如烷基羰基或烷基羰基氧基甲基等)的烷基部分是指例如碳原子数为1-12个，优选碳原子数1-6个，优选碳原子数1-4个的直链、支链、环状、或者它们的组合组成的烷基。更具体地说，作为烷基，优选低级烷基(碳原子数1-6个的烷基)。作为低级烷基，例如可以列举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、环丙基甲基、正戊基、正己基等。在本说明书中，在卤原子的情况下，氟原子、氯原子、溴原子或者碘原子都可以，优选氟原子、氯原子或溴原子。
对氨基保护基的种类没有特别的限定，例如可以适当利用对硝基苯磺酸基、三氟乙酰基、三烷基甲硅烷基等。关于氨基的保护基，例如可以参照“有机合成中的保护基”，T.W.Green著，John Wiley & Sons有限公司(1981年)等。
在上述通式(IA)和(IB)中，在苯环上取代的R1和R2的位置没有特别的限定。R2是氢原子时，优选R1对于用-COOR7表示的基团(形成内酯环时对应的羰基)结合在间位或对位上。通式(II)的苯环上取代的氨基的位置没有特别的限定，优选相对于用-COOR17表示的基团，是间位或对位。在通式(IIIA)和(IIIB)中，在苯环上取代的Y的位置没有特别的限定，优选Y对于用-COOR27表示的基团(形成内酯环时对应的羰基)结合在间位上。
在用上述通式(IA)和(IB)表示的化合物中，优选R1和R2之一是氢原子，另一个是用式(A)表示的基团。在用式(A)表示的基团中，X1至X4，优选X1和X2是2-吡啶基甲基。在用上述通式(IA)和(IB)表示的化合物中，优选m是0，n是1，且X4是氢原子，此时，优选X1和X2同时是2-吡啶基甲基。作为R5和R6，优选氢原子，在成像的用途中，优选R5和R6是乙酰基或乙酰氧基甲基。优选R3和R4同时是氢原子或者同时是氯原子。R7优选是氢原子。
在用上述通式(II)表示的化合物中，优选R13和R14同时是氢原子或者同时是氯原子。R17和R18是氢原子。
在用上述通式(IIIA)和(IIIB)表示的化合物中，优选R21和R22之一是氢原子，另一个是用式(B)表示的基团。在用式(B)表示的基团中，X11至X14，优选X11和X12是2-吡啶基甲基。在用上述通式(IIIA)和(IIIB)表示的化合物中，优选p是0，q是1，且X14是氢原子，此时，优选X11和X12同时是2-吡啶基甲基。优选R23和R24同时是氢原子或者同时是氯原子。作为R25和R26，优选氢原子，另外在成像的用途中，优选R25和R26是乙酰基或乙酰氧基甲基。R27优选是氢原子。
用上述通式(I)至(III)表示的本发明的化合物可以作为酸加成盐或者碱加成盐存在。作为酸加成盐，例如可以列举出盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐等无机酸盐，或者甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、草酸、柠檬酸、酒石酸等有机酸盐，作为碱加成盐，可以列举出钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等金属盐、铵盐或者三乙胺盐等有机胺盐。除这些之外，有时也形成和甘氨酸等氨基酸的盐。本发明的化合物或其盐也有作为水合物或溶剂化物存在的情况，这些物质都包含在本发明的范围中。
用上述通式(IA)、(IB)、(II)、(IIIA)和(IIIB)表示的本发明的化合物根据取代基的种类，有具有1个或2个以上不对称碳原子的情况，不仅基于1个或2个以上不对称碳原子的光学活性体或基于2个以上不对称碳原子的非对映异构体等的立体异构体、并且立体异构体的任意混合物、外消旋体等都包含在本发明的范围内。另外，R7、R17或者R27是氢原子时，也有羧基形成内酯的情况，本发明的范围中也包含这样结构的异构体。另外，通式(IA)中的R5是氢原子的化合物和通式(IB)中的R7是氢原子的化合物相当于互变异构体，通式(IIIA)中的R25是氢原子的化合物和通式(IIIB)中的R27是氢原子的化合物相当于互变异构体。这样的互变异构体的存在容易被本领域技术人员理解，应该理解为本发明的范围包含任意一种互变异构体。
本发明化合物的代表性化合物的制造方法显示在下述的方案中。另外，在本说明书的实施例中，更详细且具体地显示了记载在该方案中的制造方法。因而，本领域技术人员根据这些说明，适当选择反应原料、反应条件和反应试剂等，根据需要，通过对这些方法进行修改或改变，全都可以制造上述通式表示的本发明的化合物。另外，可以按照例如龟谷哲治著，有机合成化学IX，南江堂，215页(1977年)，制造可作为原料化合物使用的4-氨基荧光素、5-氨基荧光素和6-氨基荧光素。
例如可以通过下述方案的方法，使用作为反应试剂和反应原料的市售化合物等来制造通式(III)的化合物。
用上述通式(I)、通式(II)和通式(III)表示的本发明的化合物(具有氨基保护基的化合物除外)或其盐作为锌荧光探针是有用的。用上述通式(I)、通式(II)或通式(III)表示的本发明的化合物或其盐其自体不具有发出强的荧光的性质，但捕集锌离子而形成锌络合物时，则能够发出强的荧光。上述化合物或其盐具有可以特异性捕集锌离子且极其快速形成络合物这样的特征。形成的锌络合物还具有通过在生物体组织和细胞中不产生障碍的长波长范围的激发光而发出强的荧光这样的特征。因而，用上述通式(I)、通式(II)或通式(III)表示的本发明的化合物或其盐作为在生理条件下测定生物细胞和生物组织中的锌离子浓度的锌荧光探针是极其有用的。另外，本说明书中使用的所谓“测定”术语包含定量和定性测定，应该作最广义的解释。
本发明的锌荧光探针的使用方法没有特别的限定，可以和以往公知的锌探针同样使用。通常，将选自用上述通式(I)表示的化合物及其盐的物质溶解在生理盐水或缓冲液等水性介质或者乙醇、丙酮、乙二醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺等水混合性有机溶剂和水性介质的混合物等中，将该溶液添加到含有细胞和组织的适当的缓冲液中，只要测定荧光光谱就可以。
例如，对于上述方案中的化合物6和化合物12的锌络合物，激发波长分别是491nm和492nm，荧光波长分别是513nm和514nm，在约1-10μm的浓度下使用时，可以测定10μM以下浓度的锌离子。另外，将本发明的锌荧光探针和适当的添加剂组合，以组合物的形式使用也可以。例如，可以和缓冲液、溶解助剂、pH调节剂等添加剂组合。
另外，例如化合物22具有大致可以容易透过细胞膜的脂溶性，透过细胞膜后，通过细胞质内存在的酯酶，得到水解的化合物12。化合物12由于其水溶性，透过细胞膜困难，可以在细胞内长时间停留。因而，化合物22对于测定存在于各个细胞内的锌离子是极其有用的。
实施例下面通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。实施例中化合物的号码对应于上述方案中的化合物号码。
例1化合物6的合成将5.2g(16mmol)碳酸铯加到在50ml二甲基甲酰胺中溶解了2.5mg(7.2mmol)4-氨基荧光素(1)的溶液中。接着，往该溶液中添加3.1ml(15mmol)新戊酸酐，在室温下搅拌1小时。用桐山漏斗过滤反应液，减压下蒸馏除去二甲基甲酰胺后，用硅胶柱精制，得到化合物2(3.6g)。白色固体。收率97％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)7.19(m，1H)，7.02(d，2H，J＝2.4)，6.93-6.94(m，2H)，6.88(d，2H，J＝8.7)，6.77(dd，2H，J＝8.7，2.4)，4.06(br，2H)，1.34(s，18H)MS(FAB)516(M++1)m.p.206-208℃(用甲醇重结晶)将化合物2(1.0g，2.0mmol)溶解在15ml吡啶中，添加1.2g(5.3mmol)4-硝基苯磺酰基氯后，在室温下搅拌6小时。减压下蒸馏除去吡啶，将残渣溶解在25ml醋酸乙酯中。用2N盐酸、饱和食盐水洗涤该醋酸乙酯溶液后，用硫酸钠干燥。在减压下蒸馏除去醋酸乙酯后，通过硅胶柱精制，得到化合物3(1.2g)。白色固体。收率88％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.33(d，2H，J＝9.0)，8.05(d，2H，J＝9.0)，7.69(d，1H，J＝2.2)，7.45(dd，1H，J＝8.2，2.2)，7.07(d，1H，J＝8.2)，7.06-7.04(m，2H)，6.77-6.74(m，4H)，1.36(s，18H)MS(FAB)701(M++1)m.p.245-247℃(用醋酸乙酯+正己烷重结晶)将0.48g(1.5mmol)碳酸铯、1.3ml(14mmol)1，2-二溴乙烷加到在25ml二甲基甲酰胺中溶解了化合物3(0.97g，1.4mmol)的溶液中，在60℃下搅拌20小时。减压下蒸馏除去二甲基甲酰胺，溶解到50ml醋酸乙酯中。用水、饱和食盐水洗涤该醋酸乙酯溶液后，用硫酸钠干燥。在减压下蒸馏除去醋酸乙酯后，通过硅胶柱精制，得到化合物4(0.78g)。白色固体。收率70％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.38(d，2H，J＝9.0)，7.86(d，2H，J＝9.0)，7.76(d，1H，J＝2.0)，7.45(dd，1H，J＝8.0，2.0)，7.17(d，1H，J＝8.0)，7.08(m，2H)，6.85-6.84(m，4H)，4.01(t，2H，J＝6.8)，3.45(t，2H，J＝6.8)，1.37(s，18H)MS(FAB)807，809(M++1)m.p.280-281℃(用乙腈重结晶)将化合物4(0.10g，0.13mmol)悬浮在4ml乙腈中，添加55mg(0.33mmol)碘化钾、43mg(0.31mmol)碳酸钾、78mg(0.39mmol)2，2’-二皮考基胺，回流14小时。在减压下蒸馏除去乙腈后，溶解在2N碳酸钠水溶液中，用二氯甲烷萃取。用饱和食盐水洗涤二氯甲烷层后，用硫酸钠干燥。在减压下蒸馏除去二氯甲烷，通过硅胶柱精制，得到化合物5(80mg)。淡黄色油。收率69％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.47-8.45(m，2H)，8.32(d，2H，J＝9.0)，7.77(d，2H，J＝9.0)，7.69-7.61(m，3H)，7.61(d，2H，J＝7.9)，7.27-7.23(m，1H)，7.14(m，2H)，7.07(d，2H，J＝2.2)，6.99(d，1H，J＝8.0)，6.82(dd，2H，J＝8.6，2.2)，6.72(d，2H，J＝8.6)，3.82(s，4H)，3.82(m，2H)，2.72(t，2H，J＝6.4)，1.37(s，18H)MS(FAB)926(M++1)将26mg(0.19mmol)碳酸钾、12μl(0.12mmol)苯硫酚添加到在4ml二甲基甲酰胺中溶解了化合物5(34mg，37μmol)的溶液中，在室温下搅拌3小时。将在1ml甲醇和1ml水中溶解了70mg(1.2mmol)氢氧化钾的溶液加到反应混合物中，在室温下搅拌20小时。将2ml、2N盐酸加到该混合物中后，在减压下蒸馏除去溶剂。在10ml乙醇中悬浮并过滤后，在减压下蒸馏除去乙醇。用逆相色谱HPLC精制残渣，得到化合物6(15mg)。褐色固体。收率70％。1H-NMR(CD30D，300MHz)8.61-8.59(m，2H)，8.04-7.98(m，2H)，7.63(d，2H，J＝7.9)，7.51-7.46(m，2H)，7.14(d，1H，J＝2.0)，7.02(d，2H，J＝9.0)，6.95-6.87(m，4H)，6.79(dd，2H，J＝9.0，2.4)，4.46(s，4H)，3.50(t，2H，J＝6.0)，3.25(m，2H)MS(FAB)573(M++1)例2化合物12的合成和化合物2的合成法一样，由3.5g(10mmol)5-氨基荧光素(7)，得到化合物8(4.4g)。白色固体。收率84％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)7.77(d，1H，J＝7.9)，7.01(d，2H，J＝2.0)，6.95(d，2H，J＝8.6)，6.80-6.75(m，3H)，6.22(d，1H，J＝1.7)，4.21(br，2H)，1.36(s，18H)MS(FAB)516(M++1)m.p.161-163℃(用甲醇重结晶)和化合物3的合成法一样，由化合物8(3.6g，6.9mmol)得到化合物9(4.1g)。白色固体。收率84％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.61(br，1H)，8.20(d，2H，J＝9.0)，7.88(d，1H，J＝8.3)，7.81(d，2H，J＝9.0)，7.33-7.29(m，1H)，7.05(d，2H，J＝2.2)，6.84(d，1H，J＝1.8)，6.74(dd，2H，J＝8.6，2.2)，6.69(d，2H，J＝8.6)，1.38(s，18H)MS(FAB)701(M++1)m.p.189-191℃(用醋酸乙酯+正己烷重结晶)和化合物4的合成法一样，由化合物9(0.51g，0.73mmol)得到化合物10(0.35g)。白色固体。收率60％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.11(d，2H，J＝9.0)，8.10-8.09(m，1H)，7.71(dd，1H，J＝8.2，1.8)，7.56(d，2H，J＝9.0)，7.02(d，2H，J＝2.2)，6.86(dd，2H，J＝8.6，2.2)，6.79(d，2H，J＝8.6)，6.43(d，1H，J＝1.8)，3.85(t，2H，J＝6.6)，3.40(t，2H，J＝6.6)，1.38(s，18H)MS(FAB)807，809(M++1)m.p.268-269℃(用乙腈重结晶)和化合物5的合成法一样，由化合物10(0.31g，0.38mmol)，得到化合物11(0.27g)。淡黄色固体。收率75％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.45-8.42(m，2H)，8.06(d，2H，J＝9.0)，7.96(d，1H，J＝8.3)，7.64-7.59(m，2H)，7.52(d，2H，J＝9.0)，7.53-7.50(m，1H)，7.33(d，2H，J＝7.7)，7.17(m，2H)，7.00(d，2H，J＝2.2)，6.78(dd，2H，J＝8.6，2.2)，6.64(d，2H，J＝8.6)，6.48(d，1H，J＝1.3)，3.71(s，4H)，3.67(t，2H，J＝6.2)，2.67(t，2H，J＝6.2)，1.37(s，18H)MS(FAB)926(M++1)m.p.146-148℃(用甲醇重结晶)和化合物6的合成法一样，由化合物11(20mg，22μmol)，得到化合物12(6.6mg)。褐色固体。收率53％。1H-NMR(CD3OD，300MHz)8.44-8.42(m，2H)，7.94-7.88(m，2H)，7.60(d，1H，J＝8.4)，7.49(d，2H，J＝7.9)，7.45-7.41(m，2H)，6.71(br，1H)，6.65(d，2H，J＝2.4)，6.61(d，2H，J＝8.8)，6.51(dd，2H，J＝8.8，2.4)，6.02(d，1H，J＝1.8)，4.30(s，4H)，3.28(t，2H，J＝6.0)，3.03(t，2H，J＝6.0)MS(FAB)573(M++1)
例3化合物15的合成将16g(84mmol)4-硝基酞酸酐(13)和24g(0.17mol)4-氯间苯二酚溶解在250ml甲磺酸中，在氩气下，在80℃搅拌60小时。冷却至室温后，一点一点地添加至冰水1.4L。滤取析出的固体，得到37g化合物15。收率定量。
化合物16的合成将20g(45mmol)化合物(15)悬浮在700ml水中，添加54g(0.23mol)硫化钠9水合物和20g(0.25mol)硫氢化钠n水合物(硫氢化钠约70％)。在氩气下，回流20小时。冷却至室温后，添加盐酸，使pH为3-4。滤取析出的固体，得到19g化合物(16)。收率定量。
化合物17的合成和化合物(2)的合成法一样，由4.4g(11mmol)化合物(16)，得到3.9g化合物(17)。收率62％。
MS(FAB)584，586，588(M++1)化合物18及18’的合成和化合物(3)的合成法一样，由3.8g(6.5mmol)化合物(17)，得到1.9g化合物(18)，1.8g化合物(18’)。收率化合物(18)38％，化合物(18’)35％。
化合物(18)1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.38(d，2H，J＝8.7)，8.07(d，2H，J＝8.7)，7.72(d，1H，J＝2.1)，7.48(dd，1H，J＝8.1，2.1)，7.12(d，1H，J＝8.1)，7.11(s，2H)，6.77(s，2H)，1.40(s，18H)MS(FAB)769，771，773(M++1)化合物(18’)1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.26(d，2H，J＝8.6)，7.93(d，1H，J＝8.4)，7.84(d，2H，J＝8.6)，7.27(dd，1H，J＝8.4，2.0)，7.13(s，2H)，6.99(d，1H，J＝2.0)，6.75(s，2H)，1.42(s，18H)MS(FAB)769，771，773(M++1)化合物19的合成和化合物(4)的合成法一样，由1.5g(2.0mmol)化合物(18)，得到1.2g化合物(19)。收率66％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.39(d，2H，J＝9.0)，7.85(d，2H，J＝9.0)，7.79(d，1H，J＝2.0)，7.51(dd，1H，J＝8.2，2.0)，7.18(d，1H，J＝8.2)，7.14(s，2H)，6.89(s，2H)，4.06(t，2H，J＝6.8)，3.50(t，2H，J＝6.8)，1.40(s，18H)MS(FAB)875，877，879，881(M++1)化合物19’的合成和化合物(4)的合成法一样，由1.5g(2.0mmol)化合物(18’)，得到0.70g化合物(19’)。收率40％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.19(d，2H，J＝9.0)，8.13(d，1H，J＝8.3)，7.70(brd，1H)，7.62(d，2H，J＝9.0)，7.11(s，2H)，6.84(s，2H)，6.63(d，1H，J＝1.8)，3.94(t，2H，J＝6.4)，3.46(t，2H，J＝6.4)，1.41(s，18H)MS(FAB)875，877，879，881(M++1)化合物20的合成和化合物(5)的合成法一样，由1.0g(1.1mmol)化合物(19)，得到0.56g化合物(20)。收率49％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.50-8.47(m，2H)，8.33(d，2H，J＝8.7)，7.76(d，2H，J＝8.7)，7.70-7.60(m，3H)，7.46(d，2H，J＝7.9)，7.32(brd，1H，J＝8.3)，7.16-7.12(m，2H)，7.14(s，2H)，7.00(d，1H，J＝8.3)，6.79(s，2H)，3.87(t，2H，J＝6.0)，3.83(s，4H)，2.76(t，2H，J＝6.0)，1.41(s，18H)MS(FAB)994，996，998(M++1)化合物20’的合成和化合物(5)的合成法一样，由0.20g(0.23mmol)化合物(19’)，得到75mg化合物(20’)。收率33％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.43-8.41(m，2H)，8.17(d，2H，J＝9.0)，7.97(d，1H，J＝8.3)，7.63-7.57(m，2H)，7.56(d，2H，J＝9.0)，7.49(brd，1H，J＝8.3)，7.31(d，2H，J＝7.7)，7.16-7.12(m，2H)，7.08(s，2H)，6.79(s，2H)，6.72(d，2H，J＝1.1)，3.74(t，2H，J＝6.2)，3.71(s，4H)，2.74(t，2H，J＝6.2)，1.40(s，18H)MS(FAB)994，996，998(M++1)化合物21的合成和化合物(6)的合成法一样，由0.26g(0.26mmol)化合物(20)，得到98mg化合物(21)。收率35％。1H-NMR(CD3OD，300MHz)8.56(brd，2H，J＝4.8)，7.98-7.91(m，2H)，7.57(d，2H，J＝7.9)，7.46-7.41(m，2H)，6.94-6.81(m，3H)，6.73(s，2H)，6.56(s，2H)，4.48(s，4H)，3.50(t，2H，J＝5.5)，3.29(t，2H，J＝5.5)MS(FAB)641，643，645(M++1)化合物21’的合成和化合物(6)的合成法一样，由0.20g(0.20mmol)化合物(20’)，得到58mg化合物(21’)。收率26％。1H-NMR(CD30D，300MHz)8.45-8.43(m，2H)，7.93-7.88(m，2H)，7.58(d，1H，J＝8.6)，7.50(d，2H，J＝7.9)，7.45-7.41(m，2H)，6.72(s，2H)，6.73-6.88(m，1H)，6.58(s，2H)，6.01(d，1H，J＝1.8)，4.30(s，4H)，3.27(t，2H，J＝5.7)，3.06(t，2H，J＝5.7)MS(FAB)641，643，645(M++1)化合物22的合成将140mg(0.13mmol)化合物(12)悬浮在10ml乙腈中，添加0.19g(0.30mmol)碳酸铯后，一点一点添加28μl醋酸酐。在室温下搅拌1小时后，过滤反应液。在减压下蒸馏除去溶剂后，用硅胶柱精制，得到79mg化合物(22)。收率94％。1H-NMR(CDCl3，300MHz)8.51-8.49(m，2H)，7.73(d，1H，J＝8.4)，7.60-7.54(m，2H)，7.31(d，2H，J＝7.7)，7.15-7.11(m，2H)，7.05(d，2H，J＝2.2)，6.96(d，2H，J＝8.6)，6.80(dd，2H，J＝2.2，8.6)，6.77-6.74(m，1H)，6.48(br，1H)，6.02(d，1H，J＝1.7)，3.86(s，4H)，3.06(br，2H)，2.82(t，2H，J＝5.1)，2.31(s，6H)例4使用在上述例1中得到的化合物6和例2中得到的化合物12，评价对于锌离子的选择性。将5μM化合物6或化合物12加到100mM含有各种金属离子(5μM或5mM)的HEPES缓冲液(pH7.5)中，对于化合物6，在激发波长491nm，荧光波长513nm，对于化合物12，在激发波长492nm，荧光波长514nm，测定荧光强度。结果示于图1(化合物6)和图2(化合物12)。另外，将1μM化合物21加到100mM含有各种金属离子(1μM或5mM)的HEPES缓冲液(pH7.5)中，在激发波长505nm，荧光波长522nm，测定荧光强度。结果示于图3中。
图中，对于纵轴的荧光强度，将不添加金属离子时的荧光强度设为1，用数值表示添加各金属离子时的荧光强度。本发明的化合物6和化合物12对于锌离子具有极高的选择性，即使在生物体内大量存在的钠离子、钾离子、钙离子、镁离子以高浓度(5mM)存在的条件下，荧光强度也完全没有增加。另外，也可以看出这些金属离子不对由锌离子的荧光强度增大产生影响。
化合物21显示出对锌高的选择性。特别是，在生物体内大量存在的金属离子钠、钾、钙、镁即使在5mM的高浓度下添加，荧光强度也几乎没有增大。另外，这些金属离子不对由锌的荧光强度增大产生影响。
例5将锌离子(最终浓度5μM，50μM)加到100mM含有5μM化合物6、化合物12或ACF-1(特愿平11-40325号的实施例1中作为化合物(20)记载的具有环状聚胺部分的化合物)的HEPES(pH7.5)中，测定荧光强度。对于化合物6，在激发波长491nm，荧光波长513nm，对于化合物12，在激发波长492nm，荧光波长514nm，对于ACF-1，在激发波长495nm，荧光波长515nm，测定荧光强度。结果示于图4中。图中，纵轴表示相对荧光强度。从该结果可以看出，对于ACF-1，荧光强度没有瞬时增大，而对于本发明的化合物6和化合物12，荧光强度瞬时增大了。因而，使用本发明的化合物时，可以在极短的时间内检测出锌，也可以检测出锌的快速浓度变化。 例6测定将各种浓度的锌离子加到100mM含有5μM化合物6、化合物12、ACF-1或者Newport Green(Handbook of Fluorescent Probesand Research Chemicals，第6版，Richard P.Haugland，pp.531-540)的HEPES缓冲液(pH7.5)时的荧光强度的变化。对于化合物6，在激发波长491nm，荧光波长513nm，对于化合物12，在激发波长492nm，荧光波长514nm，对于ACF-1，在激发波长495nm，荧光波长515nm，对于Newport Green，在激发波长505nm，荧光波长530nm，测定荧光强度。结果示于图5中。图中，对于纵轴的荧光强度，将不添加金属离子时的荧光强度设为1，用数值表示添加各浓度的锌离子时的荧光强度。本发明的化合物6和化合物12显示出高的测定灵敏度。特别是，证明了化合物12的测定灵敏度非常高，螯合部分和发荧光部分的组合是最佳的。
例7研究了化合物12以及化合物21和这些化合物的锌络合物的荧光强度变化对于pH的变化。对于化合物12，在激发波长492nm，荧光波长514nm，对于化合物21，在激发波长505nm，荧光波长522nm，测定荧光强度。结果示于图6中。
使用以下的缓冲液100mM Cl2CHCOOH-Cl2CHCOONa缓冲液(pH2.0)100mM ClCH2COOH-ClCH2COONa缓冲液(pH3.0)100mM AcOH-AcONa缓冲液(pH4.0，4.5，5.0)100mM MES缓冲液(pH5.5，6.0，6.5)100mM HEPES缓冲液(pH7.0，7.5，8.0)100mM CHES缓冲液(pH8.5)和化合物12比较，可以看出化合物21在细胞内的pH为7.4附近荧光强度稳定，是难于受到细胞内pH变化影响的探针。
例8使用大鼠的海马切片来研究由缺血刺激产生的荧光强度的变化。
将10μM化合物22加到大鼠的海马切片中，培养后，进行10分钟(图中2分-12分)缺血刺激，并看到荧光像的时间变化。结果示于图7中。
海马切片的制作使用如下组成的林格氏液。
(1)林格氏液组成124mM NaCl、1.25mM NaH2PO4、2.5mM KCl、2mMCaCl2、26mM NaHCO3、1mM MgCl2、10mM葡萄糖(2)缺血用林格氏液组成124mM NaCl、1.25mM NaH2PO4、2.5mM KCl、2mMCaCl2、26mM NaHCO3、1mM MgCl2、10mM 2-脱氧葡萄糖(3)胆碱-林格氏液组成124mM胆碱、1.25mM NaH2PO4、2.5mM KCl、0.5mMCaCl2、26mM NaHCO3、2.5mM MgCl2、10mM葡萄糖用于切片的调制和测定的林格氏液通常通入95％O2/5％CO2气体。
用乙醚将Wistar大鼠(200-250g，雄性)麻醉。断头后，迅速摘出全脑，将其放入冰冷的胆碱-林格氏液中，放置10分钟。在涂满冰冷的胆碱-林格氏液和呈果酱状的胆碱-林格氏液的培养皿上划分为左右半球，除去间脑，用刮勺取出海马。将海马放到琼脂上，用别针固定，用旋转刮刀切成300μm大小。将切片的海马放入加热到30℃的林格氏液中，放置30分钟至1小时。在室温下，将海马放置在林格氏溶液中直至使用。
接着，用林格氏液将在10mM DMSO中溶解了化合物22的溶液稀释至10μM。将海马切片放入该溶液中，遮光，在室温下培养1.5小时。移到另外的林格氏溶液中进行替换，大约30分钟至1小时30分钟洗净后，移到室中并进行测定。在室内循环通常将温度加热到33-34℃的林格氏液(流速2-3ml/分)。用倒立显微镜(奥林巴斯IX-70)进行测定(物镜4倍，二色性镜505nm)。
缺血刺激根据以下要点通过交换在室内循环的林格氏液进行。
林格氏液(通入95％O2+5％CO2)2分(图表中从01 00.00至02 00.00)→缺血用林格氏液(通入95％N2+5％CO2)10分(图表中03 00.00至12 00.00)→林格氏液(通入95％O2+5％CO2)4分(图表中由13 00.00至16 00.00)。
从该结果可以看出，在报导的通过缺血刺激引起细胞死亡的CA1区域，从缺陷刺激开始约3分钟后，荧光强度增大。
而且，如图8所示，缺血刺激后，在CA1区域(图中1，2，3)荧光强度显著增大。即使在CA3区域(图中4)、齿状回(图中6，7)，荧光强度也增大。图的纵轴以在测定开始时(0.00秒)的荧光强度为1.00来表示。
工业实用性本发明的化合物作为用作锌测定的荧光探针是有用的。特别是，本发明的化合物具有在极短的时间内可以形成和锌的络合物这样的特征，由于测定敏感度极其高，所以作为正确测定在生物体内的锌离子的快速浓度变化的试剂是极其有用的。
权利要求
1.用下述通式(IA)或(IB)表示的化合物或其盐 式中，R1和R2分别独立地表示氢原子或者用下述式(A)表示的基团 式中，X1、X2、X3和X4分别独立地表示氢原子、烷基、2-吡啶基甲基或者氨基的保护基，m和n分别独立地表示0或1，R1和R2不能同时是氢原子；R3和R4分别独立地表示氢原子或者卤原子；R5和R6分别独立地表示氢原子、烷基羰基或者烷基羰基氧基甲基，R7表示氢原子或者烷基。
2.用下述通式(II)表示的化合物或其盐 式中，R13和R14分别独立地表示氢原子或卤原子；R17表示氢原子或烷基；R18表示氢原子或氨基的保护基。
3.权利要求2记载的化合物或其盐，R17和R18是氢原子。
4.权利要求2或权利要求3记载的化合物或其盐，R13和R14同时是氢原子或者R13和R14同时是氯原子。
5.用下述通式(IIIA)或(IIIB)表示的化合物或其盐 式中，R21和R22分别独立地表示氢原子或用下述式(B)表示的基团， 式中，X11、X12、X13和X14分别独立地表示氢原子、烷基、2-吡啶基甲基或者氨基的保护基，p和q分别独立地表示0或1，R21和R22不能同时是氢原子；Y表示-CO-NH-或-NH-CO-；R23和R24分别独立地表示氢原子或卤原子；R25和R26分别独立地表示氢原子、烷基羰基或者烷基羰基氧基甲基；R27表示氢原子或烷基。
6.一种锌荧光探针，含有权利要求1-5任意一项权利要求记载的化合物(但是引入氨基保护基的化合物除外)或它们的盐。
7.一种锌络合物，由权利要求1-5任意一项权利要求记载的化合物(但是引入氨基保护基的化合物除外)或它们的盐和锌离子形成的。
8.一种锌离子的测定方法，其特征在于将权利要求1-5任意一项权利要求记载的化合物(但是引入氨基保护基的化合物除外)或它们的盐用作锌荧光探针。
9.一种锌离子的测定方法，其特征在于包括以下工序(a)使权利要求1-5任意一项权利要求记载的化合物(但是引入氨基保护基的化合物除外)或它们的盐和锌离子反应的工序，以及(b)测定在上述工序中生成的锌络合物的荧光强度的工序。
全文摘要
作为锌荧光探针有用的用通式(IA)表示的化合物或其盐，其中[R
文档编号C09B11/28GK1407979SQ01805747
公开日2003年4月2日 申请日期2001年2月28日 优先权日2000年2月28日
发明者长野哲雄, 菊地和也, 平野智也 申请人:第一化学药品株式会社, 长野哲雄