一种非脱羧勒克菌在降解正十六烷中的应用的制作方法

本发明涉及两株非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)在无机盐培养基中高效降解正十六烷的应用。该菌株可以在不同条件下发挥好氧降解底物的能力，代谢终产物为CO₂和H₂O，通过摇瓶实验为其在土壤和沉积物环境中烷烃修复的可行性提供理论基础。

背景技术：

原油在开采、运输及储存过程中常发生原油泄漏事件，致使大量石油烃进入海洋、土壤环境，造成水体污染、土壤污染盐渍化及生物毒害等问题受到极大关注。石油烃组分复杂，具有疏水性强且毒性大的特点，主要包含烷烃、芳香烃和卤代芳烃，其中烷烃含量占50％-95％是主要的污染物，例如石油中的石蜡基轻质油主要成分就是直链C16-C36，质量分数达16.5％，黏度较大易在水体、土壤植物表面形成油膜，影响生物的呼吸和蒸腾作用。正十六烷(简称C16)作为直链烷烃重要组分之一，常被用作测定柴油燃烧质量的标准物质，常温下化学性质稳定、难挥发、疏水性强使得其难以自然降解，对环境造成持久性污染。关于石油烃的降解主要利用生物法，依靠环境中较活跃的微生物对污染物转化和降解。

目前为止，已发现能降解石油中直链烷烃常见的微生物主要有假单胞菌属(pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、节杆菌属(Archrobacter)、诺卡式菌属(Nocardia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、戈登氏菌属(Gordonia)及放线菌属(Actinomycetes)等。从含油活性污泥中筛出的非脱羧勒克菌属(Leclercia adecarboxylata)具有降解石油烃的报道只有Sarma发现其能降解多环芳烃芘，而本发明则是首次发现该菌具有高效降解正十六烷的能力。直链烷烃最常见的好氧代谢途径是单末端氧化，即烷烃末端甲基被氧化转变成对应的醇，接着依次氧化为对应的醛和脂肪酸。脂肪酸经β-氧化生成小分子乙酸，烷烃逐步被分解完毕。还有部分微生物代谢直链烷的途径是次末端氧化，转变为仲醇，依次氧化为酮和酯，同时酯易裂解为伯醇和脂肪酸，后续途径同上。Rittman发现，代谢直链烷烃的微生物的途径主要是单末端氧化，次末端则是次要的。

非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)国内有关报道，初见于临床医学研究领域，其为肠杆菌科的一种，对抗菌药物还具有一定的耐药性；该菌已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心得到保藏，为公众可获得的菌种。关于该菌具有生物修复污染环境的研究，只见于国内学者马娟利用该菌修复受壬基酚污染的水体环境，以及国外学者Sarma利用该菌高效降解多环芳烃芘，前者降解机理十分复杂，后者为开环氧化。上述降解机制均不能应用于直链烷烃的降解。

技术实现要素：

本发明旨在针对现有技术的不足，基于非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)具有单末端氧化正十六烷的特性，提供其在降解正十六烷中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种非脱羧勒克菌在降解正十六烷中的应用。

进一步地，上述应用具体如下：将OD值为0.6～0.8的非脱羧勒克菌富集液接种至正十六烷体积浓度为0.05％-1％的无机盐培养基(MSM)中，非脱羧勒克菌富集液与培养基的体积比为1：9；在37℃，160rpm/min摇床中培养7d。

所述MSM中pH为5～9，成分包含KH₂PO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 1g/L，NH₄Cl0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，KCl 0.01g/L，NaCl 5～150g/L，微量元素液1vol％，所述微量元素液的组分如下：CaCl₂ 0.01g/L，FeCl₃ 0.5g/L，CuSO₄ 0.38g/L，ZnSO₄1.15g/L，MnSO₄ 1.69g/L，溶剂为水。

本发明的有益效果在于：

1.该菌株在正十六烷环境下，可诱导并刺激该菌产生如表面活性剂类物质的中间产物，最终降解产物为CO₂和H₂O，且具有很好的经济性、环境友好性；扩大生产并收集该产物可与其他菌种联合用于含油污染环境修复，增大菌与油接触面积促进降解过程。

2.该菌株属于好氧异养微生物，影响该菌代谢因素较容易控制，得到最佳降解条件后可实际用于污染源修复，操作性简便。

附图说明

图1中A14、B45分别为两株非脱羧勒克菌在不同底物浓度条件下，7d底物的去除曲线。

图2中A14、B45分别为两株非脱羧勒克菌在0.3％正十六烷环境中，不同NaCl浓度条件下，7d底物的去除曲线。

图3中A14、B45分别为两株非脱羧勒克菌在0.3％正十六烷环境中，不同pH条件下，7d底物的去除曲线。

图4中A14、B45在上述最优条件下反应16d，时间与OD600和正十六烷降解率的图。

图5中A14、B45在上述最优条件下反应16d，时间与细胞干重的曲线图。

图6中A14、B45在上述最优条件下反应16d，时间与底物浓度变化的曲线图。

图7为A14的系统发育树状图。

图8为B45的系统发育树状图。

具体实施方式

实施例1：非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)的筛选。

以正十六烷为唯一碳源和能源，将1ml活性污泥加入100ml MSM培养基(正十六烷体积浓度0.01％)，37℃160rpm/min培养7d，吸取1ml发酵液上清液至含正十六烷的MSM培养基继续培养，此方法连续转接5次，期间逐步提高正十六烷浓度至0.05％，经5次驯化得到的发酵液较十分浑浊，即存在正十六烷菌。驯化液浓度稀释成10^-4倍后，涂布于LB培养基固体平板，置于37℃恒温箱中，菌落长出后进行划线分离，多次纯化后得到A14和B45两株菌，置于甘油中-80℃冷藏。A14和B45在牛肉膏蛋白胨平板上呈乳黄色，近圆形，中央略突起，表面光滑且湿润，革兰氏染色阴性；提取DNA后经PCR扩增，产物片段长度分别为1401bp(SEQ ID NO.1)和1395bp(SEQ ID NO.2)，在Genbank数据库进行Blast比对表明，两株菌与非脱羧勒克菌属(Leclercia adecarboxylata)有99％以上同源性。应用MEGA5.0软件采用Neighbor-Joining法绘制16S rDNA系统发育树，对比同源性，并结合形态特征，A14和B45菌初步鉴定为非脱羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)，分别与Leclercia adecarboxylata strain NBRC 102595和Leclercia adecarboxylata strainCIP 82.92相似度最高。

实验例2：菌株对正十六烷耐受性的实验

取实验室已纯化好经甘油保存的A14、B45分别接种至100ml已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏3g/L，胰蛋白胨粉10g/L，NaCl 15g/L)中活化培养12h，摇床设置温度为37℃、转速160r/min。在30ml无机盐培养基中{每1L体系中含KH₂PO₄ 0.5g，K₂HPO₄ 1g，NH₄Cl 0.5g，MgSO4 0.5g，KCl 0.01g，NaCl 15g/L，微量元素液1％(CaCl₂ 0.01g，FeCl₃0.5g，CuSO₄ 0.38g，ZnSO₄ 1.15g，MnSO₄ 1.69g蒸馏水1L)，pH为6.2}移入3ml活化后(OD₆₀₀＝0.6)的菌液，正十六烷浓度设为5个梯度0.05％、0.1％、0.3％、0.6％和1％(v/v)，温度设为37℃，转速160r/min，培养7d后正己烷萃取发酵液中正十六烷，萃取液脱水后取1ml用于GC测剩余浓度，计算降解率。

实验结果如图1所示。随着底物浓度增高，菌的降解能力逐渐降低。当起始浓度为0.05％时，反应7d后经检测底物几近降解完全；浓度提高至0.1％时，A14、B45降解率分别为83.3％和78.5％；当浓度为0.3％时，菌适应此浓度环境需要一定时间，相比于降解低浓度C16降解率明显降低，测得降解率分别为45.25％、49.65％。浓度≥0.6％时，菌降解率分别为33.7％、42.85％，与0.3％浓度降解效果相比，A14降解率降低趋势要快于B45，说明此浓度环境下后者适应更快。C16浓度为1％时，液面有形成较厚油膜，限制了氧的传递，抑制微生物代谢活动。此环境下，A14和B45降解率依然有22.1％和19.77％，该菌对底物均有较好耐受性,但高浓度C16对菌体毒害较大。

实验例3：盐度影响C16降解的实验

配制初始C16浓度0.3％的无机盐培养基(成分同实例1)，保持生长条件不变，NaCl浓度设为5、15、25、35、45、100、150g/L七个梯度，调节pH至6.2，向30ml培养体系中移入3ml活化后(OD₆₀₀＝0.6)的菌液，37℃，160r/min培养7d后正己烷萃取发酵液中正十六烷，萃取液脱水后取1ml用于GC测剩余浓度，计算降解率。

实验结果如图2所示。A14、B45在NaCl浓度为15g/L时有最高降解率分别为45.25％和49.65％，A14在NaCl浓度分别为5、15、25、35g/L时的降解率依次该菌耐盐度具有广谱性，A14降解率分别为35.55％、45.25％、31.7％、25.3％；B45降解率分别为30.85％、49.65％、33.55％、26.4％。当浓度≥45g/L时，各菌降解率急剧下降，高盐环境下由于盐析作用使得微生物的脱氢酶、氧化酶活性降低，同时溶液渗透压势必增高，致使细胞脱水造成原生质分离，影响菌体代谢活动。极高盐度环境下即100g/L和150g/L，测得OD₆₀₀值极低，A14降解率分别为6.05％和2.5％，B45降解率分别为4.45％和1％，推测非脱羧勒克菌具有一定的耐盐能力，高盐环境下对正十六烷仍有降解效果。

实验例4：pH影响C16降解的实验

配制初始C16浓度0.3％的无机盐培养基(成分同实例1)，该菌最适NaCl浓度为15g/L，调整pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0五个梯度，向30ml培养体系中移入3ml活化后(OD₆₀₀＝0.6)的菌液，37℃，160r/min培养7d后正己烷萃取发酵液中正十六烷，萃取液脱水后取1ml用于GC测剩余浓度，计算降解率。

实验结果如图3所示。A14和B45分别在pH为7.0和6.0时降解率最高，分别为52.47％和51.4％，较最佳NaCl浓度下的降解率分别提高了7.22％和1.75％。各pH下，A14的降解率分别为28.46％、41.3％、52.47％、25.2％、16.33％；B45的降解率分别为22.45％、51.4％、43.49％、28.51％、13.99％。pH是影响菌体生长的重要因素，过低或过高pH将改变细胞膜的通透性，结构稳定性及物质的电离性从而控制菌体对C16的利用，造成微生物生长速率的变化，进而影响菌的降解率。不同的微生物有不同的最适pH值范围，A14适应pH范围较广；B45降解率受pH变化影响较大，在弱酸环境(pH＝5-6)，pH与降解率呈正相关，当pH值逐渐上升，降解率不断减小且酸性环境(pH＝5-7)降解效果优于碱性环境(pH＝7-9)。

实验例5：菌株A14和B45代谢16d正十六烷实验

配制初始C16浓度0.3％的无机盐培养基(成分同实例1)，最适NaCl浓度为15g/L，pH为7.0，向30ml培养体系中移入3ml活化后的A14菌液(OD₆₀₀＝0.6)；B45培养基pH为6.0，其余条件同上，37℃，160r/min培养16d，每隔2d测一次OD₆₀₀、细胞干重及正十六烷降解率。发酵液稀释一倍并以空白培养基为对照，600nm波长下紫外分光光度法测细菌OD₆₀₀；发酵液4℃，13000r/min离心10min后的沉淀加入一定量无菌生理盐水，经生理盐水洗过后菌体再次离心，重复离心，移去上清至60℃烘箱干燥12h，称量菌体干重；正己烷萃取发酵液中正十六烷，萃取液脱水后取1ml用于GC测剩余浓度，计算降解率。

实验结果如图4所示。菌株对C16的降解率呈逐渐增加的趋势，在第16d时各菌对C16的降解率依次为93.74％，87.79％，初始底物质量浓度由2.32g/L降至0.145，0.283g/L，降解效果较好，所测OD₆₀₀得知A14、B45从第12d起开始进入稳定期，OD₆₀₀曲线和降解率变化趋势大致相同，显示出菌体的生长和底物的消耗是一个相关过程。

Logistic方程广泛运用于对生长于条件限制性环境中微生物对数期，稳定期生长状态的分析，方程式经变型后为式(1)其中：X_t为t时刻菌体干重，g/L；X₀为初始菌体干重，g/L；μ_m为各菌最大比生长速率，d^-1；X_max整个反应阶段菌的最大干重量，g/L。

$In\frac{X_t}{X_{\max }-X_t}={\mathrm{\μ}}_{m}t-In(\frac{X_{\max }}{X_0}-1)---\left(1\right)$

X_max和t时刻X值可测得，通过非线性二乘法对原始数据按Logistic方程拟合发现相关性良好，求得斜率μ_m和后，计算出A14、B45的X₀分别为0.288g/L，0.529g/L。A14直线方程为y＝-1.689+0.1375x(r²＝0.75006)，生长动力学方程B45直线方程为y＝-1.05+0.066x(r²＝0.85246)，生长动力学方程

根据C16剩余浓度与时间的关系作非线性拟合，发现底物降解符合一般生化反应都遵循的一级反应动力学规律。可以用方程(2)来表示，其中C_t是t时刻C16浓度，g/L；C₀是初始C16浓度，g/L；K是降解速率常数，d^-1；求得半衰期t_1/2＝(In2)/K,d

C_t＝C₀e^-Kt (2)

非脱羧勒克菌对C16降解复合一级反应动力学，且线性相关性较高，A14和B45的降解速率常数分别为0.118d^-1、0.103d^-1，半衰期分别为5.874d，6.729d，A14的降解能力要强于B45。一级动力学方程分别为C_t＝2.633e^-0.118t(r²＝0.91625)，C_t＝2.635e^-0.103t(r²＝0.91673)。

非脱羧勒克菌作为首次发现可高效降解长链烷烃正十六烷的菌株，本发明只作了较为简单的关于正十六烷降解特性的分析，其大批量生产、制成固定化菌剂用于实际受石油污染环境的修复的可行性还有待与深入研究。GC图谱发现C16的保留时间大约在6.97min，发酵液中C16峰面积相比于空白样有明显减小，该菌降解效果较好，由图推测产物十六醇、十六醛及十六酸的出峰时间大约在7.72min，8.49min及8.75min，出峰间隔时间与文献接近，推测代谢C16的途径可能也是单末端氧化。图7和图8为两株非脱羧勒克菌的系统发育树状图。