用于检测试样中的微生物的方法

专利名称：用于检测试样中的微生物的方法
用于检测试样中的微生物的方法
技术领域：
本发明的目的是通过显现由待检查的个体对由微生物产生的电磁信 号的抑制来显现人和动物中的潜伏性感染。
根据Jacques BENVENISTE医生的工作和专利申请WO 00/17637， 已知在借助计算机的声卡的模拟-数字转换之后，记录并数字化了具有生 物活性的分子的特征电信号。
还在现有技术(WO 09417406)中已知一种用于将生物活性从称作带 菌者的第一介质传送到称作目标的第二介质(不含所述带菌者介质的任何 痕量并在物理上与带菌者介质分离)的方法和设备，在开始时目标不具有 所述生物活性。该方法包括(i)使包括关注的生物活性的带菌者介质暴 露给电信号或电磁信号的传感器，(ii)放大辐射出的表示生物活性的特征 电磁信号或电信号，然后(iii)使目标介质暴露给电信号或电磁信号的辐 射器，所述辐射器通过传输和放大电路连接到所述传感器，以便将生物活 性的特征信号传送到所述目标。
在2005年12月14日提交的至今尚未公开的先前的法国专利申请 05/12686中，本发明的发明人描述了用于表征具有生物活性的生物化学成 分的方法，在存在微生物的情况下，通过分析低频电磁信号，所述方法提 供了对现有技术的改进。所述方法还涉及包括以下步骤的生物学分析记 录与已知的生物化学成分相对应的电磁的或电的"标记"，并且将所述预 先记录的"标记"与待表征的生物化学成分的"标记"相比较。所述方法 包括过滤和稀释的步骤以^t消除出现在初始试样中的微生物和单元，最强 的稀释产生最强的电信号或电磁信号，而最少稀释试样往往不产生电信号 或电磁t信号。发明人还示出不同性质的微生物，如细菌和病毒，产生持续 在水溶液中的"纳米结构"，并且正是这些"纳米结构"辐射电磁信号。 所述"纳米结构"表现如同具有对于病毒而言小于0.02jun而对于常MX 寸的细菌而言小于O.ljim的尺寸的聚合物，并且具有介于1.12和1.30g/ml 之间的密度。
在本申请中描述的方法基于以下惊人的观测在没有物理接触的情况 下，包含细菌的或病毒的滤液的试样(弱稀释的并且在电信号或电磁信号
4的辐射方面为阴性)的密闭管的直，见邻近区域，抑制由同一滤液的更强稀 释的试样(在电信号或电磁信号的辐射方面初始为阳性)所产生的信号。在本申请中，该抑制将不加区别地称为"抑制效应"或"阻碍效应"(effet n6gativant)。类似地，在本申请中，"抑制"和"阻碍"将被不加区别地 使用并具有相似的含义。该观测促使发明人研究基于被感染的人体的相似 的抑制现象。已观察到在患有感染源的自身免疫微血管炎的病人身上， 其血浆的稀释试样对于辐射电磁信号(下面表示为SEM)的E. coli (大 肠杆菌)稀释滤液具有抑制效应，从而提示病人受到该病原体微生物或类 似病原体微生物的慢性感染。还可发现前面示例中提到的患有微血管炎 的病人，抑制从他/她的经过滤和稀释的血浆中辐射出的SEM，并且还抑 制由存在于密闭管中的经过滤和稀释的E. coli的培养的试样所辐射的 SEM。在这种情况下，阳性稀释、;W^病人手中接触5分钟或到距离50cm 时经过10分钟就足以观察到抑制效应。因此该抑制能力同时涉及其自身血浆的辐射结构和特种细菌病原体 微生物的辐射结构，这允许使用后者作为通用的鉴定方法。因此本发明可允许在尚未鉴定病原体微生物的疾病中确定细菌源或 病毒源。本发明的第一目的涉及一种配制试剂的方法，所述试剂用于检测微生 物、尤其用于检测人或动物中的感染的试验。根据其最广泛的含义，所述 方法包括以下步骤a) 对包含选定的特种微生物的生物液体或Ait液体的培养基进行离 心分离；b) 对在步骤a)中获得的上层清液进行过滤；c) 配制一系列与在步骤b)中获得的滤液的递增稀释、直到滤液的至 少10"倍的稀释相对应的稀释试样；d) 使在步骤c)中获得的稀释试样经受电、磁和/或电磁类型的激励场；e) 在对通过螺线管检测到的电信号进行模拟/数字转换之后对所述电 信号进行分析并且对所述电信号进行数字记录；f) 选择在步骤e)中提供了特征电信号的稀释试样，特征电信号也就 是幅度是由水辐射的背景噪声信号的至少1.5倍和/或具有向更大数值的 频移的信号；g) 将在步骤f)中选择的稀释试样引入防护罩中，所述防护罩保护所述稀释液免受极低频率的外部电磁场的干扰；h) 将步骤g)的所述稀释试样之一逐渐分配到两个管中， 一个管Tl ， 保留在保护所述稀释试样免受外部电磁场的干扰的一个防护革中，管Tl 将用作参照溶液，而另一个管T2也处于一个防护革中，管T2在以后将 面对或接触被怀疑包含所述选定的特种微生物的试样。"针对所述选定的特种微生物存在与否而进行试验的试样"是指(i) 疑为被所述选定的特种微生物感染的人或动物的个体，或者(ii)疑为包 含所述选定的特种微生物的生物提取物、生物液体或Ait液体，或者(iii) 倾向于包含所述选定的特种微生物的食用、美容用或药用的成分。生物液体是指任何来自人或动物的液体，例如血液、尿液以及各种分 泌物。Ait液体是指任何允许微生物培养的重构液体，例如用于细菌、酵 母菌、霉菌以及被病毒感染的细胞的培养基的各种肉汤培养液(bouillons de culture )。本发明的另 一个目的涉及一种在试样中检测微生物的系统。该系统包括a) 包含辐射特征电磁信号的参照试样的管Tl,特征信号也就是幅度 是由水辐射的背景噪声信号的至少1.5倍和/或具有向更大数值的频移的 信号；b) 包含辐射特征电磁信号的试样的管T2，所述试样与所述管T1中 包含的试样相同；c) 保护所述管Tl和T2免受极低频率的外部电磁场的干扰的防护革；d) 包含不呈现电磁〖信号辐射的核对溶液的管T3;e) 电磁信号的接收设备。在检测时，管T2被设置为与针对选定的特种微生物的存在与否而进 行试验的试样X相面对或接触。本发明的另一目的涉及一种在试样中检测微生物的方法，其特征在 于，所述方法包括以下步骤a)将应该被证实疑有微生物存在的试样X布置为面对如在根据权利 要求l-3中任一项所述方法的步骤f)之后获得的试样，所述微生物例如是E. coli,如在步骤f)之后获得的所述试样是来自包含疑为存在于试样X中 的所述微生物的培养或生物培养基的滤液的稀释液；b)将由在步骤a)中获得的、面对如在步骤f)之后获得的试样的试样 X所辐射的电磁信号与由未受试样X影响的、如在步骤f)之后获得的相同 试样的等分试样所辐射的电磁信号进行比较。"试样X"是指(i)疑为被所述选定的特种微生物感染的人或动物 的个体，或者(ii)疑为包含所述选定的特种微生物的生物提取物、生物 液体或Ait液体，或者(m)倾向于包含所述选定的特种微生物的食用、 美容用或药用的成分。根据本发明的方法允许(i)在必须有迅速和不扩散的响应的情况下 (例如涉及检测禽流感病毒的情况)，配制用于检测与慢性疾病相关的微 生物的试验的和/或用于检测系统潜伏性感染的试剂，(ii)鉴定人或动物 的感染。一旦已鉴定了致病微生物，就可以通过借助该微生物的特种寡核普酸 引物以实现超敏感PCR (聚合,反应)来确认该病原体微生物的存在。通过阅读后面的描述可更好地理解本发明，所述描述非限定性地示出 根据本发明的方法的实施例。附图对应于非限定性的实施例。示例l:弱稀释的并且不辐射电磁信号的细菌培养"阻碍"来自相同 培养的强稀释液所辐射的电磁信号1)试样的配制E. coli (Escherichia coli，大肠杆菌)的以LB (Luria bro仇)培养基 进行的培##>乂 8000 rpm (每分钟转数)离心分离15分钟，以便除去细 胞。然后细菌的上层清液在孔隙度为0.45 n m的PEVD (极化电化学气相 沉积)Millipore过滤器上被滤出，接着在孔隙度为0.1 n m的Millipore过 滤器上重新过滤。基于得到的E. coli培养的滤液(完全无菌)，可通过在用于可注入配 制的水中每次10倍地对滤液进行稀释直到10 —15来配制一系列稀释试样。 在每次稀释之间，使用涡旋在15秒期间内对相继的稀释液进行强烈搅动。这些稀释后的试样被分配到多个1.5毫升的Eppendorf锥形塑料管 中。液体的体积通常是l毫升。2)产生电磁信号的稀释试样的选择。 对每个稀释试样进行低频电磁信号的辐射测试。用于检测SEM的方法包括旨在通过接受来自各个稀释试样的电磁场 的螺线管来将所述电磁场转换成信号、尤其是电信号的步骤。从来自被分析的稀释试样的电磁场到电信号的转换被执行如下(i) 在检验期间使稀释试样经受电、磁和/或电磁类型的激励场；(ii) 在对通过螺线管检测到的电信号进行模拟/数字转换后对所述电 信号进行分析并且对所述电信号进行数字记录；(iii) 将产生特征电信号的稀释试样的选择结果存放在保护所述稀释 试样免受外部电磁场干扰的mumaal⑧材料的防护罩中，特征就是信号的 幅度是由水所辐射的背景噪声信号的至少1.5倍和/或信号具有向更大数 值的频移)。使用在

图1中示意性表示的设备来实现信号的检测。所述设备包括位 于绝缘材料桌子上的、从0到20000赫兹敏感的螺线管读取单元1。用于 步骤(ii)中的所述螺线管包括具有软铁心的线團。该线團具有300欧姆 的阻抗、6毫米的内径、16毫米的外径以及6毫米的长度。磁性软铁心被 设置为与包括待分析的稀释液的管的外壁相接触。要被读取的稀释试样被分配到1.5毫升的E卯endorf (商业名字)锥 形塑料管2中。液体的体积通常是l毫升。特征电信号的采集是在预定时段(例如介于1和60秒之间)期间进 行的。在本示例中，在6秒钟期间，每个试样被连续读取两次。螺线管发送的电信号M大并且通过信号采集卡(声卡)4进行模拟 —数字信号转换，所述信号采集卡4包括结合到计算机3的模拟 一 数字转 换器。所述模拟-数字转换器的抽样频率是需要数字化的最大频率的两 倍，例如44千赫兹。与转换后的电信号相对应的数字文件被以声音文件的形式记录在大 容量的存储器中，所述声音文件例如是WAV (波形声音文件)格式的文 件.为了处理特征电信号，可4吏用例如Matlab和SigView (商业名字) 的两个^:件。已记录的数字文件可在需要时受到数字处理，例如用于校 准信号电平的数字放大、用于消除不需要的频率的过滤、计算频谱功率分布(英文缩写为PSD),然后通过仅保留例如从140赫兹到20千赫兹的 频率带宽对该频镨功率进行截短(Matlab),或者通过Fourier (傅立叶) 变换将该频镨功率转换成频率分量(SigView )。3)无辐射的弱稀释液对由有源稀释液产生的电磁t信号辐射的抑制活 动的评估。呈现特征电信号的稀释试样是稀释到io-8、 io-9、 lcr"的试样。从io-2到10-6的稀释液是阴性的(图2 )。将包含l(T3的E. coli稀释液的等分试样的密闭管与包含l(T8的E. coli 稀释试样的等分试样的密闭管并排存放在一个罩中并在常温下存放24小 时，该罩被mum6tal⑧材料的磁屏蔽所包围。作为对比，制作了一个核对 组。该核对组由包含103的E. coli稀释试样的等分试样的管和另一包含 10-8的E.coli稀释试样的等分试样的管构成，这两个管同上处理，但p!存 放在不同的并且彼此远离的mumaal⑧材料的罩中。在mimical 材料的 罩中的存放消除了极低(5至100赫兹)的激励频率，但是未消除可能来 自环境电磁噪声的较高频率。在24小时之后，如上述那样对包含稀释试样的管进行重新分析，从 而得出与包含10-3的稀释试样的等分试样的管并排的包含io-8的稀释试样 的等分试样的管不再辐射电磁信号或辐射极弱。反之，所述核对组的管保 持不变；被"保护"不与包含10-3的稀释试样的等分试样的管接触的、包 含l(T8的稀释试样的等分试样的管对电磁信号的辐射而言保持阳性。本发明的重要特征是所观察到的阻碍效应是特殊的，也就是说无辐射 的弱稀释试样和辐射电磁信号的强稀释试样来自相同的微生物种类。因此，辐射的稀释E. coli试样仅被无辐射的弱稀释E. coli试样所"阻 碍"，而不被无辐射的弱稀释链球菌(Str印tocoque )或葡萄球菌 (Staphylocoque)试样所"阻碍"。类似地，辐射的稀释葡萄球菌试样仅 被无辐射的弱稀释葡萄球菌试样所"阻碍"，而不被无辐射的弱稀释E. coli 或,菌试样所"阻碍"。示例2:人和动物中的感染的快速并且无扩散的检测方法1)包含微生物的生物液体或Ait液体的试样的配制血液试样和大肠杆菌(E. coli) Kl的以LB (Luria broth)培养^Ji 行的悬浮培养被离心分离以便消除细胞，所iijk液试样是在抗凝血剂(优 选为肝素)的条件下从患有由细菌感染引起的神经病学的疾病的病人身上提取的。然后用RPMI培养基将得到的细菌上层清液和/或血浆稀释至 l(T2。所述溶液在0.45 ju m的PEVD Millipore过滤器上被过滤，然后所 述滤液在0.02 n m的Whatman或0.1 jim的Millipore过滤器上被重新 过滤。
基于被感染的个体的血浆的滤液和E.coliKl的培养的滤液，可通过 在层流净4t革(hotte ^ flux laminaire)的务泮下在用于可注入配制的水 中每次10倍地进行稀释来配制一系列与递增稀释、直到10"s的程JL相对 应的稀释试样。在每次稀释之间，使用涡旋在15秒期间内对相继的稀释 液进行强烈搅动。
然后稀释后的试样被分配到多个1.5毫升的Eppendorf锥形塑料管 中。液体的体积通常是l毫升。
2) 产生电磁信号的稀释试样的选择。
以与上面在第一示例、第二节中描述的方式相同的方式来实现辐射特 征信号(信号的幅度是背景噪声信号的至少1.5倍和/或信号的频率高于背 景噪声)的稀释试样的选择。方法以及材料与上述的方法以及材料相同。 因此，方法包括旨在通过接受来自各稀释液的电磁场的螺线管来将所述电 磁场转换成信号、尤其是电信号的步骤。
从来自被分析的稀释液的电磁场到电信号的转换被执行如下
(i) 在检验期间使稀释试样经受电、磁和/或电磁类型的激励场；
(ii) 在对通过螺线管检测到的电信号进:行模拟/数字转换后对所述电 信号进行分析并且对所述电信号进行数字记录；
(iii) 将呈现特征电信号的稀释试样的选择结果存放在保护所述稀释 试样免受外部电磁场干扰的防护軍中，上述特征就^1信号的幅^A由水辐 射的背景噪声信号的至少1.5倍和/或信号具有向更大数值的频移。
3) 被感染的个体对由微生物产生的电磁信号的辐射的抑制活动的评估。
在前一步骤((iii)处)选择的稀释试样(来自被感染的个体的血浆 的滤液、E.coli的培养的滤液的试样，也就^l:说具有特征电信号的滤出试 样的稀释液)，被分配(按照每管1毫升)到多个Eppendorf塑料管中并 且保持在+ 4° C。通过将这样分配为等分试样的辐射SEM的稀释试样存 放在防电磁场的軍中来使该稀释试样免受外部干扰。优选地mum6tal⑧材料实现的磁屏蔽包围罩，所i^t屏蔽将罩与来自环境中的极 低频率的干扰场隔离开。
辐射SEM的稀释试样之一(来自被感染的个体的血浆的滤液、E. coli 的培养的滤液)被逐渐分配到两个管中，两管之一Tl,保留在保护所述 稀释试样免受外部电磁场的干扰的一个防护罩中，Tl管用作参照溶液； 后面将受病人影响的另一管T2也被存放在一个防护罩中。所述防护罩优 选被mum^al⑧材料实现的屏蔽所包围。
图2示意性i^示在研究抑制效应时要被实现的步骤。抑制效应的研 究被实现如下
a) 包含参照溶液的管Tl保持存放在被mumaal⑧材料实现的磁屏蔽 包围的軍3中，因此管T1处在防止待检查的个体4的潜在恶化的位置， 而管T2受到待检查的感染个体4的影响，存在于管Tl和T2中的血浆来 自于感染个体4，所述个体在预定时段期间(例如5分钟)将T2抓在其 手5中。
b) 管T2存放在用于接收电磁信号的设备中，优选是如前面在本示例 的第二节中描述的螺线管读取单元；
c) 然后电信号救故大、处理、如前面在本示例的第二节中描述的那 样进行模拟 一数字信号转换；
d) 所述模拟-数字信号最终通过傅立叶变换被分解成谐波。
比较对应于管Tl的信号、对应于管T2的信号以;M"应于包含水的 管T3的信号(背景噪声)。
下面的图示出在有源稀释液来自被检查的感染个体的血浆的情况下 获得的结果
-图3示出由面对管T3的螺线管所检测到的电信号(背景噪声)的 三维(Matlab)频率分布-图4示出由面对管1的螺线管所检测到的频镨的三维频率分布-图5示出由面对管2的螺线管所检测到的频谦的三维频率分布-图6示出同一背景噪声(供应电流的未经过滤的谐波)的傅立叶分 析(SigView);
-图7示出由面对管1的螺线管所检测到的信号的傅立叶分析；-图8示出由面对被待检查的个体持有的管2的螺线管所检测到的频 谱的傅立叶分析。
通过分别分析背景噪声(图3)和面对包含辐射SEM的参考溶液的 管Tl时获得的信号(图4 )的三维频率分布图，出现向较高频率的移动。 反之，当分析包含受待检查的个体影响的溶液的管T2时(图5 ),未发现 向较高频率的移动；三维频率分布图示出管2的信号与针对背景噪声而获 得的信号相似。
对由管1产生的阳性频率的傅立叶分析(图7)显示了各个频率处的 尖峰。按照信号的强度逐渐变小的顺序，以下频率处呈现 信号1000、 2000、 3000、 4100、 5100以及5500。反之，对管2的傅立 叶分析显示了与通过对背景噪声的分析所获得的结^f目似的结果不论对 于背景噪声，还是对于管T2，都观察不到任何有意义的尖峰。
总之，这些分析允许作以下推断被检查的个体具有对于由其自身血 浆的稀释液所辐射的电磁信号的抑制能力。
使用基于E. coli Kl得到的参照溶液获得了类似的结果.
因此，这种抑制能力同时涉及个体自身血浆的辐射结构和大肠杆菌的 辐射结构，这提示个体已感染了产生接近大肠杆菌纳米结构的纳米结构的 因子。
权利要求
1. 一种配制试剂的方法，所述试剂用于检测微生物、尤其用于检测人或动物中的感染的试验，其特征在于所述方法包括以下步骤a)对包含选定的特种微生物的生物液体或人造液体的培养基进行离心分离；b)对在步骤a)中获得的上层清液进行过滤；c)配制一系列与在步骤b)中获得的滤液的递增稀释、直到滤液的至少10-15倍的稀释相对应的稀释试样；d)使在步骤c)中获得的稀释试样经受电、磁和/或电磁类型的激励场；e)在对通过螺线管检测到的电信号进行模拟/数字转换之后对所述电信号进行分析并且对所述电信号进行数字记录；f)选择在步骤e)中提供了特征电信号的稀释试样，所述特征电信号是幅度是由水辐射的背景噪声信号的至少1.5倍和/或具有向更大数值的频移的信号；g)将在步骤f)中选择的稀释试样引入防护罩中，所述防护罩保护所述稀释液免受外部电磁场的干扰；h)将步骤g)的所述稀释试样之一逐渐分配到两个管中，一个管T1，保留在保护所述稀释试样免受外部电磁场的干扰的一个防护罩中，管T1将用作参照溶液，而另一个管T2也处于一个防护罩中，管T2在以后将面对或接触被怀疑包含所述选定的特种微生物的试样。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物液体是来自人 或动物的液体。
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所i^Ait液体是微生物 的培养基。
4. 一种用于在试样中检测微生物的方法，其特征在于，所述方法包 括以下步骤a)将怀疑其中存在微生物的试样X布置为面对如在根据权利要求 1-3中任一项所述方法的步骤f)之后获得的试样，所述微生物例如是E. coli (大肠杆菌)，如在步骤f)之后获得的所述试样是来自包含怀疑存在于试 样X中的所述微生物的培养或生物培养基的滤液的稀释液；b)将由在步骤a)中获得的、面对如步骤f)中限定的试样的试样X所 辐射的电磁信号与由如在步骤f)之后获得的、未受试样X影响的相同试 样的等分试样所辐射的电磁信号进行比较。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述试样X是人或动物 的个体。
6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述试样X是生物的提 取物。
7. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述试样X是食用、美 容用或药用的成分。
8. —种用于在试样中检测微生物的系统a) 根据权利要求1-3之一所述方法配制的包含辐射特征电磁信号的 参照试样的管Tl，所述特征电磁信号是幅JLA由水辐射的背景噪声信号 的至少1.5倍和/或具有向更大数值的频移的信号；b) 根据权利要求1-3之一所述方法配制的包含辐射特征电磁信号的 试样的管T2，该试样与所述管Tl中包含的试样相同；c) 保护所述管Tl和T2免受外部电磁场的干扰的防护軍；d) 包含不呈现电磁t信号辐射的核对溶液的管T3;e) 电磁信号的接收设备。
9. 如权利要求8所述的系统，其特征在于，所述电磁信号的接收设 备e)包括一螺线管读取单元；-配有信号采集卡、如声卡的计算机，所述计算机包括至少一个信号 处理软件。
10. 如权利要求9所述的系统，其特征在于，所述螺线管读取单元对 于从0赫兹到20000赫兹是敏感的，所述螺线管读取单元包括具有软铁心 的线闺，所述线團具有300欧姆的阻抗、6毫米的内径、16毫米的外径以 及6毫米的长度。
11. 如权利要求8-10之一所述的系统，其特征在于，所述阴性核对 溶液T3是用于制备形成试剂Tl和T2的试样稀释液的溶液。
全文摘要
本发明涉及一种配制试剂的方法，所述试剂用于检测微生物、尤其用于检测人或动物中的感染的试验，其特征在于所述方法包括以下步骤a)对包含选定的特种微生物的生物液体或人造液体的培养基进行离心分离；b)对在步骤a)中获得的上层清液进行过滤；c)配制一系列与在步骤b)中获得的滤液的递增稀释、直到滤液的至少10^-15倍的稀释相对应的稀释试样；d)使在步骤c)中获得的稀释试样经受电、磁和/或电磁类型的激励场；e)在对通过螺线管检测到的电信号进行模拟/数字转换之后对所述电信号进行分析并且对所述电信号进行数字记录；f)选择在步骤e)中提供了特征电信号的稀释试样，特征电信号也就是幅度是由水辐射的背景噪声信号的至少1.5倍和/或具有向更大数值的频移的信号；g)将在步骤f)中选择的稀释试样引入防护罩中，防护罩保护所述稀释液免受外部电磁场的干扰；h)将步骤g)的所述稀释试样之一逐渐分配到两个管中，一个是T1，保留在保护所述稀释试样免受外部电磁场的干扰的一个防护罩中，该管用作参考溶液，而另一个管T2也处于防护罩中，该管后面将面对或接触怀疑包含所述选定的特种微生物的试样。
文档编号G01N33/483GK101506373SQ200780030875
公开日2009年8月12日 申请日期2007年6月22日 优先权日2006年6月22日
发明者吕克·蒙塔尼耶, 贾迈勒·艾萨 申请人:纳内克蒂斯生物技术公司