专利名称：铂胶复合硅凝胶膜及其制备方法和在电化学检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于钼胶复合硅溶胶-凝胶膜技术领域，具体涉及一种制备包埋固定甲基毒死蜱免疫抗原的钼胶复合硅溶胶-凝胶膜方法，以及使用该膜结合丝网印刷电极制备一次性甲基毒死蜱检测芯片的应用。
背景技术：
农药的发明和广泛应用提高了农作物产量，是现代农业生产快速发展的必要条件。但是，在带来巨大益处的同时农药残留对于环境以及人类的食品安全健康造成了一系列的不良影响。2010年发生了多起农药污染事件，从年初的海南“毒豇豆”到福建“毒乌龙”， 再到广西、云南、湖北和山东陆续曝光的蔬菜农药残留超标或含有禁用高毒农药等恶性用药事件，说明农药残留给人们的身体带来了巨大的伤害，同时也造成了恶劣的社会影响。我国的出口农产品因为农药超标问题被国外商家拒收、扣留、退货和索赔的事件也屡次发生， 给出口商和国家都造成了重大的经济损失。因此，农药污染问题成为急需监测，治理的一大焦点问题，发展实用可靠的痕量分析技术无疑是控制和监测农药残留的一个热点内容，也是保证食品安全，避免国际贸易争端的基本前提。目前，农药残留的分析方法主要包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、 气相色谱质谱联用法(GC-MS)、液相色谱质谱联用法(HPLC-MS)，利用这些方法能够定量检测农药残留，而且具有较好的稳定性和重现性。但是，这类方法依托于高灵敏度和高精密度分析仪器及其联用技术的开发，耗费昂贵，且检测时间长，需要训练有素的专业技术人员， 不利于现场检测以及基层使用的推广普及。免疫传感器便携易操作，而且只需要少量样品， 大大降低有毒试剂的消耗，经济且低碳环保，为农药的检测提供了一种简便，快速的手段。 早期的一些研究工作主要集中于胆碱酯酶抑制型和水解酶型这两类有机磷农药检测传感器的开发。本方案主要研究内容包括一种钼胶复合硅溶胶-凝胶的制备方法以及将该材料应用于制备免疫电极进行甲基毒死蜱检测。甲基毒死蜱(chlopyrifos-methyl),又名甲基氯蜱硫磷，化学名称0，0- 二甲基-0-3，5，6-三氯-2-吡啶基硫逐磷酸酯，是一种高效、低毒、低残留、广谱性的杀虫、杀螨剂，具有触杀、胃毒、薰蒸和一定的渗透作用。在中性和弱酸性环境中，甲基毒死蜱水解缓慢，其残留问题值得重视。2010年8月孝感应城就曾发生一起市民食物中毒事件，最后在他们食用的米饭中检测出有机磷农药——甲基毒死蜱。目前文献报道的一般采用气相色谱法检测甲基毒死蜱含量
发明内容
发明目的本发明的目的是为检测甲基毒死蜱的免疫方法提供一种工艺简单，成本低、稳定性高且导电性能良好的钼胶复合硅凝胶膜及其制备方法和在电化学检测中的应用，实现BSA-^Vg在电极表面的包埋固定，制备一次性甲基毒死蜱免疫检测传感器。技术方案钼胶复合硅凝胶膜，该钼胶复合硅凝胶膜由以下步骤制得 制备钼胶
第一步，将m wt聚乙烯醇与乙醇按体积比ι. 5:Γ 0: 升/升的体积比混合； 第二步，将重蒸水与氯钼酸按体积质量比0. 4:Γ1.6:1升/克比例混合； 第三步，将第一步和第二步所得取相同体积1:1溶液混合，80°c恒温油浴条件下回流3 小时，制得透明均一的钼胶溶液，在棕色瓶中4 °C保存； 制备钼胶掺杂的复合硅凝胶
第一步，取钼胶溶液与氨丙基三乙氧基硅氧烷按体积比8:广20:1升/升混合； 第二步，在第一步所得溶液中依次加入聚乙二醇，盐酸和重蒸水，体积比为 0. 625:1:0.4:1.8 升/升；
所得混合溶液置于旋涡混勻器上震荡15 min，将混合溶液与甲基毒死蜱免疫抗原按 25:广60:1的体积比混合，在旋涡混勻器上震荡5 min, 500 r/min，于4°C条件下避光陈化 24小时，制得BSA-Ag —钼胶复合硅凝胶膜。钼胶复合硅凝胶膜的制备方法，制备步骤为第一步，制备钼胶按规定量将氯钼酸、乙醇和聚乙烯醇加入到重蒸水中，80°C恒温油浴条件下回流3小时，制得透明均一的钼胶溶液；第二步，制备钼胶掺杂的复合硅凝胶取钼胶溶液加入PVC离心管，依次加入规定量的聚乙二醇，氨丙基三乙氧基硅氧烷，盐酸和重蒸水，置于旋涡混勻器上震荡15 min，将混合溶液与甲基毒死蜱免疫抗原按25:广60:1的体积比混合，在旋涡混勻器上震荡5 min, 500 r/min,于4°C条件下避光陈化M小时，制得BSA-Ag —钼胶掺杂的复合硅凝胶膜。钼胶复合硅凝胶膜在电化学检测中的应用，步骤为第一步，传感器制备电极系统通过丝网印刷方法印在绝缘基板上，辅助电极为石墨电极，参比电极为Ag/AgCl电极，工作电极为碳电极，取2. 5 μ BSA-iVg—钼胶掺杂的复合硅凝胶滴涂于石墨电极表面，置于干燥器中干燥8小时，制得包埋BSA-Ag的农药检测传感器；第二步采用差分脉冲伏安法，结合竞争免疫方法，通过检测Ab-HRP催化H2A氧化o-PD的电化学信号测定样品中甲基毒死蜱的浓度。有益效果与现有技术相比，本发明具有以下特点
1、制得了具有一定机械强度和化学稳定性的亲水性多孔生物大分子固定包埋材料，且具有良好的导电性能。2、建立了峰电流与甲基毒死蜱浓度之间的线性关系，峰电流与其浓度呈线性关系，ip(A) = -2.687e"X + 6.116 e、(TP2 = 0. 99 )，检测范围为 0· 4 20 ng/mL，灵敏度为 0^69 μΑ/mM，检测限 0. 02 ng/mL。3、在土壤与葡萄样品中添加三个不同浓度的甲基毒死蜱标准品，应用制备的一次性免疫芯片进行检测，测定结果见表1。甲基毒死蜱在土壤中的平均添加回收率为 96. 4-100. 8%，在葡萄中的平均添加回收率为99. 3-109. 3%。表明免疫传感器不仅避免了复杂的样品处理过程，而且能够精密地检测实际样品中甲基毒死蜱的残留。4、将修饰好的免疫芯片在4 °C条件保存一个月后，该芯片与酶标抗体温育后在H2O2，o-PD体系中检测，重现电流大小为94. 6%，说明该传感器具有较好的稳定性。制备5只相同的免疫芯片，在相同的检测条件下，相关标准误差为7. 6%，表明该免疫传感器具有较好的重现性。
图1为丝网印刷电极，包括印刷在绝缘基底上的工作电极，参比电极和辅助电极所构成的电极系统。a:辅助电极为石墨电极；b:工作电极为碳电极；c:参比电极为Ag/ AgCl电极。图2为调整膜的组份，制得不同形貌的钼胶复合硅凝胶膜的扫描电镜表征图。a. 20μ APTES, ΙΟμ HC1，45PL H2O, ΙΟμ PEG ；
b.20μ APTES,ΙΟμ HC1，45PL H2O,ΙΟμ PEG,ΙΟΟμ Pt colloidal ；
c.20μ APTES,ΙΟμ HC1，45PL H20,50μ PEG,200μ Pt colloidal ；
d.20μ APTES,ΙΟμ HC1，45PL H20,25μ PEG ,200μ Pt colloidal ； 观察电极修饰结果和SEM图均表明，加入25 μ PEG可以改善凝胶膜完整性，减少开裂
现象，d组参数可以制得疏松多孔，且平滑完整的复合物膜。因此后续实验过程中采用d组参数进行免疫电极的修饰制备。图3是不同凝胶膜修饰的免疫芯片在H2A，o-PD检测体系中的差分脉冲伏安图。 a)硅凝胶膜包埋BSA-Ag免疫芯片；b)钼胶复合硅凝胶膜包埋BSA-Ag免疫芯片。图4为不同浓度甲基毒死蜱样品对应的差分脉冲伏安曲线。免疫芯片与2. 5 μ HRP-Ab (1.2 Pg/mL)和2. 5 μ 不同浓度的甲基毒死蜱混合溶液温育后，峰电流值随甲基毒死蜱浓度的增大而减小。
具体实施例方式以下结合实例对本发明作进一步的描述 实施例1
在处理过的溶胶-凝胶(sol-gel)的前驱体(钼胶，氨丙基三乙氧基硅氧烷APTES，聚乙二醇PEG，盐酸)混合物中加入BSA-Ag，在旋涡混勻器上震荡5 min, 4°C条件静置陈化M小时，通过APTES的水解、缩聚反应，使BSA-Ag包埋于凝胶网络结构中，得到一次性免疫芯片。 该法的优势体现在操作简便，包埋在其中的蛋白质泄露程度低。具体步骤为
第一步，将11 mg氯钼酸(H2PtCl6)、2. 5 mL乙醇和3. 75 mL聚乙烯醇(PVA，2%wt) 加入18. 75 mL的重蒸水中，80°C恒温油浴条件下回流3小时，制得透明均一的钼胶溶液 (Platinum collidol)，在棕色瓶中 4°C保存。第二步，取200 μ 钼胶，20 μ 氨丙基三乙氧基硅氧烷(APTES)，25 μ 聚乙二醇(PEG，4%)，10 μ HCl (0. 04Μ)，45 μ 重蒸水，混合震荡20 min,制备得到透明均一溶胶 (sol)ο第三步，在上述得到的透明均一溶胶中加入5 PL BSA_Ag(5 mg/mL)，震荡5 min，4°C避光陈化对小时。竞争免疫检测方法，步骤为
第一步，标准甲基毒死蜱样品的配置
制备4 mg/mL的甲基毒死蜱储备液，分别稀释200，400，500，1000, 2000, 5000,10000倍后得到浓度分别为 20 ng/mL, 10 ng/mL，8 ng/mL，4 ng/mL，2 ng/mL，0.8 ng/mL，0.4 ng/mL的甲基毒死蜱溶液，在4 ！条件储存待测。第二步抗原抗体温育时间优化。利用差分脉冲伏安法，在H2O2，邻苯二胺(O-PD) 体系中进行电化学检测，记录不同温育时间的电流值，40 min后电流值趋于平稳，因此确定 40 min为最佳温育时间。第二步，确定免疫芯片结合酶标抗体的最大量。配制不同浓度的Ab-HRP，分别与一次性免疫芯片温育40 min，在H2O2，邻苯二胺(o-PD)体系中进行电化学检测，记录电流值， 确定酶标抗体的浓度阈值为1. 2 Pg/mL。第三步，竞争免疫反应温育酶标抗体。将2. 5 μ 不同浓度的甲基毒死蜱溶液(20 ng/mL, 10 ng/mL ,8 ng/mL ,4 ng/mL ,2 ng/mL ,0. 8 ng/mL ,0. 4 ng/mL)分别与 2. 5μ Ab-HRP (1. 2 Pg/mL)的混合溶液滴加在上述第二步制得的一次性免疫芯片上，25°C温育40 min，重蒸水荡洗数次，然后将芯片置于H2O2，邻苯二胺(o-PD)溶液体系中，采用差分脉冲伏安法(DPV)在CHI 660C电化学工作站上进行电化学测试。 实施例2
钼胶复合硅凝胶膜由以下步骤制得 制备钼胶
第一步，将m Wt聚乙烯醇与乙醇按体积比ι. 5:Γ10:1升/升的体积比混合； 第二步，将重蒸水与氯钼酸按体积质量比0. 4:Γ1.6:1升/克比例混合； 第三步，将第一步和第二步所得取相同体积1:1溶液混合，80°c恒温油浴条件下回流3 小时，制得透明均一的钼胶溶液，在棕色瓶中4 °C保存； 制备钼胶掺杂的复合硅凝胶
第一步，取钼胶溶液与氨丙基三乙氧基硅氧烷按体积比8:广20:1升/升混合； 第二步，在第一步所得溶液中依次加入聚乙二醇，盐酸和重蒸水，体积比为 0. 625:1:0.4:1.8 升/升；
所得混合溶液置于旋涡混勻器上震荡15 min，将混合溶液与甲基毒死蜱免疫抗原按 25:广60:1的体积比混合，在旋涡混勻器上震荡5 min, 500 r/min,于4°C条件下避光陈化 24小时，制得BSA-Ag —钼胶复合硅凝胶膜。钼胶复合硅凝胶膜在电化学检测中的应用，步骤为第一步，传感器制备电极系统通过丝网印刷方法印在绝缘基板上，辅助电极为石墨电极，参比电极为Ag/AgCl电极，工作电极为碳电极，取2. 5 μ BSA-iVg—钼胶掺杂的复合硅凝胶滴涂于石墨电极表面，置于干燥器中干燥8小时，制得包埋BSA-Ag的农药检测传感器；第二步采用差分脉冲伏安法，结合竞争免疫方法，通过检测Ab-HRP催化H2A氧化o-PD的电化学信号测定样品中甲基毒死蜱的浓度。
权利要求
1.钼胶复合硅凝胶膜，其特征在于该钼胶复合硅凝胶膜由以下步骤制得 制备钼胶第一步，将m Wt聚乙烯醇与乙醇按体积比ι. 5:Γ10:1升/升的体积比混合； 第二步，将重蒸水与氯钼酸按体积质量比0. 4:Γ1.6:1升/克比例混合； 第三步，将第一步和第二步所得取相同体积1:1溶液混合，80°c恒温油浴条件下回流3 小时，制得透明均一的钼胶溶液，在棕色瓶中4 °C保存； 制备钼胶掺杂的复合硅凝胶第一步，取钼胶溶液与氨丙基三乙氧基硅氧烷按体积比8:广20:1升/升混合； 第二步，在第一步所得溶液中依次加入聚乙二醇，盐酸和重蒸水，体积比为 0. 625:1:0.4:1.8 升/升；所得混合溶液置于旋涡混勻器上震荡15 min，将混合溶液与甲基毒死蜱免疫抗原按 25:广60:1的体积比混合，在旋涡混勻器上震荡5 min, 500 r/min,于4°C条件下避光陈化 24小时，制得BSA-Ag —钼胶复合硅凝胶膜。
2.权利要求1所述钼胶复合硅凝胶膜的制备方法，其特征在于制备步骤为第一步， 制备钼胶按规定量将氯钼酸、乙醇和聚乙烯醇加入到重蒸水中，80°C恒温油浴条件下回流 3小时，制得透明均一的钼胶溶液；第二步，制备钼胶掺杂的复合硅凝胶取钼胶溶液加入 PVC离心管，依次加入规定量的聚乙二醇，氨丙基三乙氧基硅氧烷，盐酸和重蒸水，置于旋涡混勻器上震荡15 min，将混合溶液与甲基毒死蜱免疫抗原按25:广60:1的体积比混合，在旋涡混勻器上震荡5 min, 500 r/min,于4°C条件下避光陈化M小时，制得BSA-Ag —钼胶掺杂的复合硅凝胶膜。
3.钼胶复合硅凝胶膜在电化学检测中的应用，其特征在于步骤为第一步，传感器制备电极系统通过丝网印刷方法印在绝缘基板上，辅助电极为石墨电极，参比电极为Ag/ AgCl电极，工作电极为碳电极，取2. 5 μ BSA-iVg—钼胶掺杂的复合娃凝胶滴涂于石墨电极表面，置于干燥器中干燥8小时，制得包埋BSA-Ag的农药检测传感器；第二步采用差分脉冲伏安法，结合竞争免疫方法，通过检测Ab-HRP催化H2A氧化o-PD的电化学信号测定样品中甲基毒死蜱的浓度。
全文摘要
铂胶复合硅凝胶膜及其制备方法和在电化学检测中的应用，制备步骤为第一步，制备铂胶将氯铂酸、乙醇和聚乙烯醇加入到重蒸水中，80℃恒温油浴条件下回流3小时，制得透明均一的铂胶溶液；第二步，制备铂胶掺杂的复合硅凝胶取铂胶加入PVC离心管，依次加入氨丙基三乙氧基硅氧烷，聚乙二醇，少量盐酸和重蒸水，置于旋涡混匀器上震荡15min后加入BSA-Ag，在旋涡混匀器上震荡，于4℃条件下避光陈化24小时，制得BSA-Ag－铂胶掺杂的复合硅凝胶。
文档编号G01N27/28GK102243206SQ20111009776
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月19日 优先权日2011年4月19日
发明者刘松琴, 宗小敏, 尹立红, 潘小虎, 王璇 申请人:东南大学