专利名称：布鲁氏菌检测用杂交瘤细胞株17c8及其产生的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及以布鲁氏菌全菌为抗原免疫小鼠获得的杂交瘤细胞株17C8及其产生的单克隆抗体。
背景技术：
布鲁氏菌病是一种由布鲁氏菌引起的人畜共患病。布鲁氏菌能引起哺乳动物的流产、不孕、睾丸炎及关节炎等，同时由于它容易形成气溶胶，具有很高的传染性，所以还被用作生物战剂。传统的布鲁氏菌检测采用血清学的方法，主要包括玫瑰花环试验、试管凝集试验 (SAT)、虎红平板凝集试验(RBPT)、补体结合试验(CFT)、抗人球蛋白试验(C00MB’ S)，以及能够标准化的ELISA方法等。血清学方法的不足之处在于它的敏感性较低，而且与霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏、EHEC、沙门氏菌、福氏志贺菌等容易发生交叉反应。因此，制备布鲁氏菌高亲和力的单克隆抗体，且制备的抗体能够识别各个种型的布鲁氏菌，将为布鲁氏菌病诊断方法的研究奠定很好的基础。
发明内容
本发明的目的是提供用于布鲁氏菌检测的杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体。本发明所提供的以布鲁氏菌全菌为抗原免疫小鼠获得的杂交瘤细胞株，名称为 17C8，细胞株17C8已于2011年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 4971。由杂交瘤细胞株17C8产生的单克隆抗体命名为17C8anti，来源于小鼠属小鼠 (Mus musculus)，也属于本发明的保护范围。17C8 CGMCC No. 4971产生的单克隆抗体与所有布鲁氏菌毒株(如M4A、16M、临床株S95(与16M为同种菌)等)以及疫苗株(如52工195、10411等)均能够产生特异性免
疫反应。本发明的另外一个目的是提供一种制备上述单克隆抗体的方法。具体来讲，本发明单克隆抗体的制备方法，可包括以下步骤1)用布鲁氏菌全菌抗原作为免疫原免疫动物；2)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞；3)筛选并培养杂交瘤细胞；4)从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的动物的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体。在上述单克隆抗体的制备方法中，步骤1)中的布鲁氏菌全菌抗原可为活菌或灭活菌，优选为活菌抗原，浓度为lX108-lX109CFU/mL;用于制备单克隆抗体的免疫动物可为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、驴、马等哺乳动物，优选为小鼠。步骤2~)中当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，可分离动物的脾细胞并制备成单细胞悬液。必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞，并在适当的融合剂(如聚乙二醇)的诱导下与骨髓瘤细胞(优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合以形成杂交瘤。步骤3)中可以在选择性培养基(如HAT培养基)中培养以筛选融合的杂交瘤细胞，并进一步可使用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的阳性抗性细胞株。步骤4)中可于体外(如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(作为小鼠腹水)培养所选择的分泌区分布鲁氏菌毒株和疫苗株的单克隆抗体的杂交瘤，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出单克隆抗体。本发明还提供了一种检测布鲁氏菌的试剂盒。本发明所提供的检测布鲁氏菌的试剂盒，包含有杂交瘤细胞株17C8 CGMCC No. 4971产生的单克隆抗体。本发明提供了以布鲁氏菌全菌为抗原免疫小鼠获得的杂交瘤细胞株17C8 CGMCC No. 4971及其产生的单克隆抗体。实验证明，杂交瘤细胞株17C8 CGMCC No. 4971产生的单克隆抗体与所有布鲁氏菌菌株(毒株和疫苗株)均能够反应，与其它菌株不反应，特异性较高，因而可用于布鲁氏菌的检测中。根据本发明单抗株的特征，可以建立检测布鲁氏菌抗原和血清的方法，应用前景广阔。生物材料说明本发明杂交瘤细胞株，名称为17C8，为单克隆细胞株，该细胞株已于2011年6月 16日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 4971。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为小鼠三次免疫后的血清抗体效价趋势2为三次亚克隆后挑选细胞上清ELISA检测结果图3A-图3C为扩大培养各代杂交瘤细胞抗体效价检测结果
具体实施例方式实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、杂交瘤细胞株17C8 CGMCC No. 4971及其产生的单克隆抗体的获得1、菌株培养取-80°C保存菌种-布鲁氏菌强毒株Brucella melitensis 16M(简称16M，购自生物制品检定所)，按1 100比例接种于TSB培养基(购自生物梅里埃公司)中，37°C、 200rpm振荡培养48h。用接种环挑取少量，在TSA平板(购自北京欣经科生物技术有限公司)上划线分纯，37°C培养7 后，挑取单个菌落接种5mL TSB培养基中，37°C、200rpm振荡培养48h。按1 100比例转接到200mL TSB培养基中，培养至对数中期。在菌液中加入终浓度为4% (体积百分浓度)甲醛溶液，室温作用IOmin灭活细菌。将灭活的16M菌液6000rpm离心lOmin，收集菌体，然后用PBS稀释至1 X 108CFU/mL,和活菌1 X 109CFU/mL 一起作为全菌免疫抗原。2、动物免疫整个免疫过程将小鼠(SPF级，Balb/c小鼠，雌性，6_8周龄，体重18_22g，购于军事医学科学院实验动物中心)分为两组(每组4只)进行，A组为灭活全菌抗原免疫组，B 组为活菌免疫组。取全菌抗原(活菌1 X 109CFU/mL或灭活菌1 X 108CFU/mL)与弗式完全佐剂(购自Sigma公司)按1 1比例混合，乳化抗原直至达到油包水状态。采取皮下注射方式免疫，每只0. 2mL。分别于初次免疫后第四周和第六周用弗式不完全佐剂(购自Sigma 公司)按同样方法分别对小鼠进行第二次免疫和第三次免疫。每次免疫一周后，由小鼠尾静脉取血50 μ 1测定抗体效价。选择血清效价高的小鼠脾脏进行细胞融合实验。融合前3 天，取效价较高的小鼠以腹腔注射方式，注射1. 5 X 108CFU/mL全菌抗原0. 5mL，作为加强免疫一次。3、抗体效价测定取免疫小鼠和健康小鼠尾静脉血50 μ 1，室温静置lh，4°C放置ai，3000rpm离心 lOmin，收集血清，4°C保存备用。采用间接ELISA方法对上述收集血清进行抗体效价测定。 检测血清或腹水效价时，对血清或腹水用PBS做倍比(依次稀释800倍、1600倍、3200倍、 6400倍)稀释，ΙΟΟμΙ/孔，以正常小鼠血清为阴性对照。用同样方法检测细胞上清的效价，无菌条件下取细胞上清，100 μ 1/孔加样到包被好的酶标板中，同时，每板分别选取无细胞生长的两孔为阴性对照。另外，酶联板两孔加入阳性血清作为阳性对照。以450nm单波长测定各孔OD值，以空白孔调零。以OD > 0. 2作为判定阳性，以与阴性对照孔OD值比值 (P/N)大于2. 1为限，判定为效价临界值。三次免疫后血清抗体效价测定结果如表1-表3和图1所示，可以看出随着免疫次数的增加，小鼠血清的效价明显升高，并且布鲁氏菌活菌免疫组免疫后的抗体效价优于灭活全菌抗原免疫组。因此，下一步细胞融合中选择了活菌全抗原免疫后效价最高的B组 4号小鼠作为细胞融合对象。表1第一次免疫后效价(1 800,1 1600,1 3200,1 6400为稀释比例)
权利要求
1.以布鲁氏菌全菌为抗原免疫小鼠获得的杂交瘤细胞株17C8CGMCC No. 4971。
2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株17C8CGMCC No. 4971产生的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于与所有布鲁氏菌毒株以及布鲁氏菌疫苗株均能够产生特异性免疫反应。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于所述布鲁氏菌毒株为M4A、临床株 S95和16M,所述疫苗株为S2、S19、M5和104M。
5.一种制备权利要2-4任一项所述单克隆抗体的方法，包括以下步骤1)用布鲁氏菌全菌抗原作为免疫原免疫动物；2)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞；3)筛选并培养杂交瘤细胞；4)从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的动物的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤1)中的布鲁氏菌全菌抗原为活菌或灭活菌，优选为活菌抗原，浓度为IX IO8-I X 109CFU/mL;用于制备单克隆抗体的免疫动物为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、驴、马等哺乳动物，优选为小鼠。
7.权利要求1所述的杂交瘤细胞株17C8CGMCC No. 4971在布鲁氏菌检测中的应用。
8.权利要求2-4任一项所述的单克隆抗体在布鲁氏菌检测中的应用。
9.一种检测布鲁氏菌的试剂盒，包含有权利要求2-4任一项所述的单克隆抗体。
全文摘要
本发明提供了以布鲁氏菌全菌为抗原免疫小鼠获得的杂交瘤细胞株17C8 CGMCC No.4971及其产生的单克隆抗体。所述单克隆抗体的制备方法包括以下步骤1)用布鲁氏菌全菌抗原作为免疫原免疫动物；2)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞；3)筛选并培养杂交瘤细胞；4)从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的动物的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体。实验证明，杂交瘤细胞株17C8CGMCC No.4971产生的单克隆抗体与所有布鲁氏菌菌株(毒株和疫苗株)均能够反应，特异性较高，因而可用于布鲁氏菌的检测中。根据本发明单抗株的特性，可以建立检测布鲁氏菌抗原和血清的方法，应用前景广阔。
文档编号G01N33/577GK102391993SQ20111036329
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者于爽, 杜昕颖, 汪舟佳, 王玉飞, 苑锡铜, 袁静, 陈泽良, 黄留玉 申请人:中国人民解放军疾病预防控制所