一种龟甲胶及其制品的检测物及其检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测龟甲胶及其制品的方法，其利用龟甲胶制品与其他仿制品基因组中具有特异性核苷酸序列或氨基酸序列的不同进行检测，所述特异性氨基酸序列如SEQ.ID?No1所示。本发明的方法，能够快速检测龟甲胶及其制品中的驴、马、牛、猪、羊、鹿等伪品成分，从而分辨真伪。本发明还涉及多肽，及其由所述多肽与相应载体组成的组合物。此外，还包括所述多肽及其组合物在检测龟甲胶及其制品中驴、马、牛、猪、羊或鹿源性成分中的应用。
【专利说明】一种龟甲胶及其制品的检测物及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种驴、马、牛、猪、羊或鹿源性成分的检测物及其检测方法，具体可应用于龟甲胶及其制品的真伪鉴定，属于中药检测领域。
【背景技术】
[0002]龟甲，即龟科动物乌龟(Chinemys reevesii)的背甲及腹甲，属于传统名贵中药。据最新版的中国药典记载，服用龟甲能够滋阴潜阳，益肾强骨，养血补心。近些年来，随着生物学水平的提高，龟甲的相关研究也不断深入。有研究表明，龟甲粉末及其提取物不仅能够增强肝功能、缓解压力，还具有抗癌以及调节免疫抵抗力的功效。以龟甲为原料而制成的两类产品龟苓膏和龟甲胶在整个中药市场上占据着重要的位置。
[0003]据2010年版中国药典记载，龟甲胶是以龟甲为原料，经水煎煮、浓缩制成的固体胶，性咸、甘、凉，归肝、肾、心经。能够滋阴、养血、止血，主要用于阴虚潮热、骨蒸盗汗、腰膝酸软、血虚萎黄、崩漏带下等。长期服用龟甲胶还有利于增强机体自身调节，能够延年益寿，也利于阴虚阳亢患者的身体康复。随着生活水平的不断提高，与阿胶类似，龟甲胶也成为人们进补的首选之一。
[0004]由于龟甲自身比较名贵，药用价值显著，并且龟肉也常常用于烹饪各类补品供人们食用，近些年来对各种龟类的捕杀现象十分严重，甚至于某些龟类品种濒临灭绝。因此，龟甲原料的供应非常有限，并且价格高昂，也直接影响到了龟甲胶的生产。在龟甲胶市场上存在某些假冒伪劣产品，其制作原料并非龟甲，而是由其他动物杂皮、碎骨代替，包括猪皮、牛皮，甚至病死动物之皮，脏皮、烂皮等。该类假冒伪劣产品一旦成形，无论外观、色泽、气味都与正品龟甲胶及其相似，真伪难辨。服用这些伪品不仅没有任何疗效，还很可能对身体有害，后果十分严重。
[0005]胶类中药由动物的皮、骨、甲等熬制而成胶类物质，包括阿胶、龟甲胶、鹿角胶等，具有典型民族特色的传统中药。胶类中药一般经长时间高温蒸煮浓缩而成，主要成分非常相近且不同厂家的生产工艺存在差异，采用红外、近红外、X-衍射等方法对胶类中药纯品进行真伪鉴别常存在判断不准确等情况。胶类中药中龟源性成分的鉴别，已有学者从DNA角度进行鉴别，但只是定性，存有假阴性与假阳性现象，且操作较为复杂。有报道称从多肽的角度利用质谱检测胶类中药中龟源性成分，结果准确可靠。但目前还没有从胶原多肽的角度，一次性鉴别龟甲胶及其制品中伪品成分的检测方法。
[0006]胶类中药中主要成分为胶原蛋白多肽，不同动物的胶原蛋白氨基酸序列存在差异，除乌龟之外的不同物种中，含有的稳定存在的同一多肽可作为龟甲胶中伪品成分的特征性多肽，通过限制性内切酶酶切，利用质谱完全可以对龟甲胶进行溯源鉴定。
【发明内容】
[0007]本发明针对上述问题，提供了一种龟甲胶及其制品的检测物及其真伪鉴定方法，该方法操作简单，特征性强，灵敏度高，可用于龟甲胶及其制品中伪品成分的溯源鉴定。[0008]本发明的技术方案如下:
[0009]首先，本发明提供了一种检测龟甲胶及其制品的方法，其利用龟甲胶制品与其他仿制品基因组中具有特异性核苷酸序列或氨基酸序列的不同进行检测，所述特异性氨基酸序列如SEQ.1D Nol所示。
[0010]优选的，所述龟甲胶制品选自龟甲胶制成的食品、保健品或药品中的一种，且配方中不含有驴、马、牛、猪、羊、鹿源性成分。
[0011]优选的，所述其他仿制品是指驴、马、牛、猪、羊或鹿中的一种或几种熬制而成的胶类物质。
[0012]更具体地，所属包括如下步骤:
[0013](I)选取龟甲胶制品与其他仿制品基因组中特异性氨基酸序列或氨基酸序列，所述特异性氨基酸序列如SEQ.1D Nol所示；
[0014](2)将龟甲胶或其制品溶解，或提取所述龟甲胶或其制品的蛋白多肽类成分并溶解，随后加入限制性内切酶进行酶切；
[0015](3)将步骤(2)得到的酶切后的溶液放入液质联用仪，以龟甲胶纯品为基质，加入步骤(I)所述氨基酸序列作为对照，并选择该氨基酸序列的母离子m/z443.7及其子离子进行监测。
[0016]如果检出该离子的保留时间与对照品一致，且其子离子与对照品的子离子一致，则所述龟甲胶或其制品中含有该伪品成分；如果没有与对照品保留时间一致的该离子，则不含有该伪品成分。
[0017]优选的，步骤(2)中所述溶解所用的试剂是质量百分数为1%、pH值8.0的NH4HCO3溶液；所述限制性内切酶为胰蛋白酶。
[0018]进一步地，本发明提供了一种检测龟甲胶及其制品的分子标记物，该分子标记物的氨基酸序列如SEQ.1D Nol所示。
[0019]进一步地，本发明提供了编码所述的蛋白的基因。
[0020]进一步地，本发明提供了所述的分子标记物在检测龟甲胶中是否含有驴、马、牛、猪、羊或鹿源性成分中的应用。
[0021]更进一步地，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学有效量的所述的蛋白和一种或多种药学上可接受的载体。
[0022]更进一步地，本发明提供了所述的药物组合物在检测龟甲胶中是否含有驴、马、牛、猪、羊或鹿源性成分中的应用。
[0023]本发明的有益效果如下:
[0024]采用本发明的方法，能够快速检测龟甲胶及其制品中的驴、马、牛、猪、羊、鹿等伪品成分，从而分辨真伪，尽管胶类中药中胶原蛋白多肽有一定水解与破坏，但本发明基于其主要成分胶原蛋白中的差异性多肽，其含量高，受破坏程度很小，可对龟甲胶及其制品中是否含有驴、马、牛、猪、羊或鹿等伪品成分进行鉴定。
[0025]本发明还涉及多肽，其氨基酸序列为Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Gln-Gly-Val-Arg,及其由所述多肽与相应载体组成的组合物。此外，还包括所述多肽及其组合物在检测龟甲胶及其制品中驴、马、牛、猪、羊或鹿源性成分中的应用。【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1是合成多肽及纯品胶多反应监测扫描模式下选择离子对m/z443.7 — 556.4、613.1监测的质谱图；
[0027]图2是合成多肽及加入5%伪品胶的混合胶多反应监测扫描模式下选择离子对m/z443.7 — 556.4,613.1 监测的质谱图；
[0028]图3是合成多肽及龟甲胶制品(龟甲胶颗粒)在多反应监测扫描模式下选择离子对m/z443.7 — 556.4,613.1 监测的质谱图。
【具体实施方式】
[0029]下面结合 具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0030]本发明中特异性肽链的获得:
[0031]I材料和试剂
[0032]材料:纯品胶包括阿胶、马皮胶、黄明胶、猪皮胶、龟甲胶、鹿角胶、羊皮胶，分别用驴皮、马皮、牛皮、猪皮、龟甲、鹿角、羊皮煎煮获得。
[0033]试剂:碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯，购自中国食品药品检定研究院)、合成多妝 Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Gln-Gly-Val-Arg。
[0034]2样品的检测前处理
[0035]( I)胶样品酶解溶液的制备
[0036]取1.0g待测胶样品于500mL量瓶中，加少量1%NH4HC03溶液，超声使样品完全溶解，用1%NH4HC03溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液ImL加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100 μ L，37 °C恒温酶解6h。
[0037](2)合成多肽对照样品酶解溶液的制备
[0038]称取一定量的合成多肽，加入1%NH4HC03溶液(pH8.0)，摇匀，配制成浓度约为
0.3 μ g/mL,微孔滤膜过滤,备用。
[0039]3多肽的发现
[0040](I)离子的发现
[0041]取5 μ L酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件=C18反相色谱柱(2.1mmX 100mm,
1.8 μ m)，流动相A为0.1%甲酸溶液【体积分数】，流动相B为乙腈，流速0.3mL/min ;梯度洗脱:0~40min，2%~50%流动相B (这里的百分数表示从O分钟到第40分钟，流动B由2%线性渐变为50%、流动相A则由98%渐变为50%)。质谱条件:电喷雾正离子模式(ESI+)进行一级全扫，扫描范围m/z400-m/zl000。
[0042]从各自胶样品的质谱全扫图中提取离子m/z443.7，通过对比发现在4.84min左右只有龟甲胶中没有该离子峰，而阿胶、马皮胶、黄明胶、猪皮胶、羊皮胶和鹿角胶中均含有。通过多批次样品的检测与验证表明上述结论正确。说明:可以通过检测龟甲胶中的离子m/z443.7，来确定是否掺杂驴、马、牛、猪、羊或鹿源性等伪品成分。
[0043](2)多肽的氨基酸序列初步推测[0044]利用三重四极杆质谱，对上述找出的离子进行子离子扫描，确认该离子带双电荷，通过序列拼接，推测出多肽的部分序列。根据推测的部分序列，在NCBKhttp: //www.ncb1.nlm.nih.gov/)数据库进行序列检索，结合其的特点(龟中没有，而驴、马、牛、猪、羊或鹿中均有，且被胰蛋白酶酶切后分子量约为887.4)，找出该多肽可能的序列Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Gln-Gly-Val-Arg0根据肽链的CID断裂理论,计算该多肽可能的子离子如下:
[0045]
【权利要求】
1.一种检测龟甲胶及其制品的方法，其利用龟甲胶制品与其他仿制品基因组中具有特异性核苷酸序列或氨基酸序列的不同进行检测，所述特异性氨基酸序列如SEQ.1D Nol所/Jn ο
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述龟甲胶制品选自龟甲胶制成的食品、保健品或药品中的一种，且配方中不含有驴、马、牛、猪、羊、鹿源性成分。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述其他仿制品是指驴、马、牛、猪、羊或鹿中的一种或几种熬制而成的胶类物质。
4.根据权利要求1?3中任意一项所述的方法，其具体包括如下步骤: (1)选取龟甲胶制品与其他仿制品基因组中特异性氨基酸序列或氨基酸序列，所述特异性氨基酸序列如SEQ.1D Nol所示； (2)将龟甲胶或其制品溶解，或提取所述龟甲胶或其制品的蛋白多肽类成分并溶解，随后加入限制性内切酶进行酶切； (3)将步骤(2)得到的酶切后的溶液放入液质联用仪，以龟甲胶纯品为基质，加入步骤(I)所述氨基酸序列作为对照，并选择该氨基酸序列的母离子m/z443.7及其子离子进行监测。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述溶解所用的试剂为1%、ρΗ值8.0的NH4HCO3溶液；所述限制性内切酶为胰蛋白酶。
6.一种检测龟甲胶及其制品的分子标记物，该分子标记物的氨基酸序列如SEQ.1D Nol所示。
7.编码权利要求6所述的蛋白的基因。
8.权利要求6所述的分子标记物在检测龟甲胶中是否含有驴、马、牛、猪、羊或鹿源性成分中的应用。
9.一种药物组合物，其特征在于，包含药学有效量的权利要求6所述的蛋白和一种或多种药学上可接受的载体。
10.权利要求9所述的药物组合物在检测龟甲胶中是否含有驴、马、牛、猪、羊或鹿源性成分中的应用。
【文档编号】G01N30/02GK103630623SQ201310518574
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】郭尚伟, 秦玉峰, 尤金花, 周祥山, 田守生, 嵇传良, 段小波, 史兆松 申请人:山东东阿阿胶股份有限公司