本发明属于食品检测技术领域，尤其涉及一种基于三维磁性分子印迹聚合物检测奶粉中三聚氰胺含量的方法。
背景技术：
随着人们消费水平和生活水平的提高，消费者对食品的安全性提出了更高的要求。乳制品作为日常营养物质是人们不可缺少的一种食物。目前，对乳制品的质量评价是以蛋白质含量为指标，目前多利用氮的含量以表示蛋白质的含量。为了提高粗蛋白含量以达到测定氮含量的实验标准，一些不法商家将三聚氰胺作为蛋白质的替代品添加到乳制品中。
三聚氰胺的分子式为c3h6n6，俗称密胺、蛋白精，学名为“2，4，6-三氨-1，3，5-三嗪”，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物。三聚氰胺是一种化工原料，几乎无味，摄入到人体内会生成三聚氰酸，三聚氰酸和三聚氰胺可形成大的网状结构，造成结石，对肾和膀胱造成严重的危害。因此检测奶制品中的三聚氰铵对保证奶制品的安全具有重要的意义。
由于奶制样品三聚氰胺浓度低，且存在大量的蛋白质，基质复杂，不能直接用于检测。因此需要采用适当的样品前处理方法以提高三聚氰胺的检测灵敏度，降低基质干扰。目前，已经建立多种方法用于奶制品中三聚氰胺的前处理，如液相萃取，固相萃取等，但是液相萃取会消耗大量的有机溶剂，固相萃取操作繁琐且萃取效率低。因此，开发简单高效的样品前处理方法对于快速灵敏检测奶制品中的三聚氰胺具有重要的意义。
技术实现要素：
为了解决奶制样品三聚氰胺检测时，传统的样品前处理方法有机溶剂消耗大、萃取效率低等问题，本发明提供了一种基于三维磁性分子印迹聚合物检测奶粉中三聚氰胺含量的方法。本发明利用选择性强的磁性分子印迹聚合物对三聚氰胺进行萃取，提高萃取效率和灵敏度的同时又避免了离心的步骤，实现了对三聚氰胺的快速灵敏检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于三维磁性分子印迹聚合物检测奶粉中三聚氰胺含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）碳纳米管的活化：将4-6g碳纳米管分散在80-120ml硝酸-低共熔溶剂的混合液中，在80-90℃，600-800rpm条件下搅拌4-6h，待分散液冷却后过滤，得到的固体用水洗涤至中性后，将固体在60-80℃条件下真空干燥12-14h，得活化的碳纳米管；
（2）三维磁性复合物的制备：将2-3g的纳米氧化石墨烯、1-2g活化的碳纳米管均匀分散在250-400ml去离子水-低共熔溶剂混合液中，向分散液中加入1.5-2.0gfecl3·6h2o和4.5-6gnaac在600-800rpm机械搅拌下混合均匀，加入1.75-2.0g的聚乙二醇混合均匀并转移到高压反应釜中，在180-250℃条件下高温反应4-6h后，冷却过滤，得到的固体依次利用乙醇、水洗涤2-3次，干燥得到三维磁性复合物；
（3）三维磁性分子印迹聚合物的制备：将步骤（2）得到的三维磁性复合物粉碎后分散于去离子水-低共熔溶剂混合液中，依次加入0.05-0.1g三聚氰胺、0.1-0.2g丙烯酸混合均匀后，加入0.2-0.4g乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.01-0.02g偶氮异丁腈，在55-70℃，600-800rpm机械搅拌下反应10-12h，利用磁铁对材料进行吸附，将吸附到的固体依次用水和乙醇洗涤3次，经干燥、粉碎制备得到三维磁性分子印迹聚合物；
（4）奶粉样品的制备：取3-5g奶粉并将其与6-10ml甲醇-水混合液混合，在45-60℃，400-600w条件下超声15-25min后离心，取清液即得奶粉样品；
（5）奶粉样品中三聚氰胺的萃取检测：将4-5mg的三维磁性分子印迹聚合物加入到8-10ml奶粉样品中超声1-2min，在200-300rpm转速下混匀3-5min,利用外部的磁铁吸附三维磁性分子印迹聚合物并倒掉上清液，利用100µl氢氧化铵-甲醇混合液超声1min对三维磁性分子印迹聚合物进行洗脱，再通过磁铁吸附分离印迹聚合物后，最后利用高效液相色谱对上清液中的三聚氰胺进行分析。
优选的，步骤（1）中所述的碳纳米管的直径为5-10nm；所述的硝酸-低共熔溶剂中低共熔溶剂为氯化胆碱-甘油、氯化胆碱-乙二醇、四甲基氯化氮-甘油、四甲基氯化铵-乙二醇中的一种，所述低共熔溶剂的浓度为0.4-0.6g/ml,所述硝酸的浓度为1-2mol/l。
优选的，步骤（2）中所述的纳米氧化石墨烯的粒径为20-40nm;所述的低共熔溶剂为步骤（1）所用的低共熔溶剂，所述去离子水-低共熔溶剂混合液中低共熔溶剂的体积分数为5-15%；所述三维磁性复合物粉末在去离子水-低共熔溶剂混合液中的浓度为0.2-0.04g/ml。
优选的，步骤（3）中所述的低共熔溶剂为氯化胆碱-丙烯酸、氯化胆碱-衣康酸、四甲基氯化铵-丙烯酸、四甲基氯化铵-衣康酸中的一种；所述的去离子水-低共熔溶剂混合液中低共熔溶剂的浓度为0.02-0.1g/ml;所述三维磁性复合物在去离子水-低共熔溶剂混合中的浓度为0.02-0.05g/ml。
优选的，步骤（3）中所述的三维磁性分子印迹聚合物的粒径不大于100nm。
优选的，步骤（4）中所述的甲醇-水混合液中甲醇的体积分数为15-25%；所述的甲醇-水混合液中含有0.01g/mlnacl。
优选的，步骤（5）中所述的氢氧化铵-甲醇混合液中甲醇的体积分数为35-50%。
本发明方法基质干扰小，灵敏度高，与现有技术相比，本发明所述的一种基于三维磁性分子印迹聚合物检测奶粉中三聚氰胺含量的方法具有以下有益效果：本发明采用特异性分子印迹材料对三聚氰胺进行选择性萃取，方法萃取效率高、基质效应小；将磁性材料嫁接到分子印迹聚合物中，减少了萃取时离心的步骤，缩短了萃取时间；利用低共熔溶剂作为反应的溶剂和修饰剂，不仅减少了有机溶剂的消耗而且低共熔试剂可以作为功能性聚合物，加强材料的吸附效果。本发明能与高效液相色谱、毛细管电泳、液相色谱-质谱等多种仪器联用，适合多种奶粉以及含有牛奶的粉末状食品中三聚氰胺的检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明所作出的变化或等同替换，均应属于本发明的保护范围。
实施例一
一种基于三维磁性分子印迹聚合物检测奶粉中三聚氰胺含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）碳纳米管的活化：将5g碳纳米管分散在100ml2mol/l硝酸-0.45g/ml氯化胆碱-甘油低共熔溶剂的混合液中，在90℃，700rpm条件下搅拌5h，待分散液冷却后过滤，得到的固体用水洗涤至中性后，将固体70℃条件下真空干燥13h，得活化的碳纳米管；
（2）三维磁性复合物的制备：将2.5g纳米氧化石墨烯、1g活化的碳纳米管均匀分散在300ml去离子水-10%(v/v)氯化胆碱-甘油低共熔溶剂混合液中，向分散液中加入1.5gfecl3·6h2o和4.5gnaac在700rpm机械搅拌下混合均匀，加入1.5g聚乙二醇混合均匀并转移到高压反应釜中，在220℃条件下高温反应4h后，冷却过滤，得到的固体依次利用乙醇、水洗涤2次，干燥得到三维磁性复合物；
（3）三维磁性分子印迹聚合物的制备：将步骤（2）得到三维磁性复合物粉碎后分散于去离子水-0.15g/ml氯化胆碱-丙烯酸低共熔溶剂混合液中，依次加入0.06g三聚氰胺、0.15g丙烯酸混合均匀，加入0.3g乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.01g偶氮异丁腈，在60℃，700rpm机械搅拌下反应11h后利用磁铁对材料进行吸附，将吸附到的固体依次用水和乙醇洗涤3次，经干燥、粉碎制备得到三维磁性分子印迹聚合物；
（4）奶粉样品的制备：取4g奶粉并将其与8ml15%甲醇-0.01g/mlnacl水混合液混合后在50℃，500w条件下超声25min并离心，取清液即得奶粉样品；
（5）奶粉样品中三聚氰胺的萃取检测：将4mg三维磁性分子印迹聚合物加入到8ml奶粉样品中超声1min，在250rpm转速下混匀4min,利用外部的磁铁吸附三维磁性分子印迹聚合物并倒掉上清液，利用100µl氢氧化铵-45%甲醇混合液超声1min对三维磁性分子印迹聚合物进行洗脱，再通过磁铁吸附分离印迹聚合物，最后利用高效液相色谱对上清液中的三聚氰胺进行分析。
实施例二
一种基于三维磁性分子印迹聚合物检测奶粉中三聚氰胺含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）碳纳米管的活化：将6g碳纳米管分散在120ml2mol/l硝酸-0.45g/ml氯化胆碱-乙二醇低共熔溶剂的混合液中，在90℃，800rpm条件下搅拌5h，待分散液冷却后过滤，得到的固体用水洗涤至中性后，将固体在70℃条件下真空干燥14h，得活化的碳纳米管；
（2）三维磁性复合物的制备：将3g的纳米氧化石墨烯、1.2g活化的碳纳米管均匀分散在350ml去离子水-10%(v/v)氯化胆碱-乙二醇低共熔溶剂混合液中，向分散液中加入2.0gfecl3·6h2o和5.5gnaac在700rpm机械搅拌下混合均匀，加入1.5g聚乙二醇混合均匀并转移到高压反应釜中，在250℃条件下高温反应4h后，冷却过滤，得到的固体依次利用乙醇、水洗涤3次，干燥得到三维磁性复合物；
（3）三维磁性分子印迹聚合物的制备：将步骤（2）得到三维磁性复合物粉碎后分散于去离子水-0.15g/ml氯化胆碱-衣康酸低共熔溶剂混合液中，依次加入0.06g三聚氰胺、0.15g丙烯酸混合均匀后，加入0.3g乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.01g偶氮异丁腈，在60℃，700rpm机械搅拌下反应12h后利用磁铁对材料进行吸附，将吸附到的固体依次用水和乙醇洗涤3次，经干燥、粉碎制备得到三维磁性分子印迹聚合物；
（4）奶粉样品的制备：取4g奶粉并将其与8ml15%甲醇-0.01g/mlnacl水混合液混合后在50℃，500w条件下超声25min并离心，取清液即得奶粉样品；
（5）奶粉样品中三聚氰胺的萃取检测：将5mg三维磁性分子印迹聚合物加入到10ml奶粉样品中超声1min后，在250rpm转速下混匀4min,利用外部的磁铁吸附三维磁性分子印迹聚合物并倒掉上清液，利用100µl氢氧化铵-45%甲醇混合液超声1min对三维磁性分子印迹聚合物进行洗脱，再通过磁铁吸附分离印迹聚合物后，最后利用高效液相色谱对上清液中的三聚氰胺进行分析。
对比例一
一种基于三维磁性分子印迹聚合物检测奶粉中三聚氰胺含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）碳纳米管的活化：将6g碳纳米管分散在120ml2mol/l硝酸-水混合液中，在90℃，800rpm条件下搅拌5h，待分散液冷却后过滤，得到的固体用水洗涤至中性后，将固体在70℃条件下真空干燥14h，得活化的碳纳米管；
（2）三维磁性复合物的制备：将3g纳米氧化石墨烯、1.2g活化的碳纳米管均匀分散在350ml去离子水-10%(v/v)甲醇混合液中，向分散液中加入2.0gfecl3·6h2o和5.5gnaac在700rpm机械搅拌下混合均匀后，加入1.5g聚乙二醇混合均匀并转移到高压反应釜中，在250℃条件下高温反应4h，冷却过滤，得到的固体依次利用乙醇、水洗涤3次，干燥得到三维磁性复合物；
（3）三维磁性分子印迹聚合物的制备：将步骤（2）得到三维磁性复合物粉碎后分散于去离子水-40%的乙醇中，依次加入0.06g三聚氰胺、0.15g丙烯酸混合均匀后，加入0.3g乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.01g偶氮异丁腈，在60℃，700rpm机械搅拌下反应12h并利用磁铁对材料进行吸附，将吸附到的固体依次用水和乙醇洗涤3次，经干燥、粉碎制备得到三维磁性分子印迹聚合物；
（4）奶粉样品的制备：取4g奶粉并将其与8ml15%甲醇-0.01g/mlnacl水混合液混合后在50℃，500w条件下超声25min并离心，取清液即得奶粉样品；
（5）奶粉样品中三聚氰胺的萃取检测：将5mg的三维磁性分子印迹聚合物加入到10ml奶粉样品中超声1min后，在250rpm转速下混匀4min,利用外部的磁铁吸附三维磁性分子印迹聚合物并倒掉上清液，利用100ul氢氧化铵-45%甲醇混合液超声1min对三维磁性分子印迹聚合物进行洗脱，然后利用磁铁吸附分离印迹聚合物后，利用高效液相色谱对上清液中的三聚氰胺进行分析。
对比例二
国标gb/t22388-2008中奶粉中三聚氰胺的前处理检测方法
（1）取2g奶粉与15ml三氯乙酸和5ml乙腈混合，超声10min，再振荡10min后在5000rpm/min条件下离心5min，得上清液，将清液过滤，得到奶粉样品；
（2）将奶粉样品转移至固相萃取柱，依次用3ml水和3ml甲醇洗涤，抽干，用6ml的胺化甲醇洗脱，收集洗脱液，样品的流速为0.8ml/min，并将洗脱液于50℃条件下氮气吹干，残留物用1ml流动相溶解后，利用高效液相色谱进行分析。
方法性能考察
(1)以仪器信/噪比的3倍作为检测限和信噪比的10倍作为定量限，检测实施例1、2和对比例1、2方法的灵敏度。
(2)以以下公式计算方法的萃取效率，检测实施例1、2和对比例1、2方法的萃取效果。
公式中v,c分别表示进样前分析样品的体积以及三聚氰胺的浓度，m表示样品中三聚氰胺的质量。
实施例1，2和对比例1，2中方法的分析参数的比较
从表中可以看出，相比于传统机溶剂制备的三维磁性分子印迹聚合物，本发明使用的低共熔溶剂制备的三维磁性分子印迹聚合物，对三聚氰胺的灵敏度更高；相比于常用的固相萃取方法，本发明的萃取时间短，萃取效率高，灵敏度高，具有更广阔的应用前景。