一种纳米金复合材料免疫传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于传感器领域，具体涉及一种纳米金复合材料免疫传感器的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]纳米金由于具有小尺寸效应、表面效应、粒度可控，在生物医学工程、电子学、催化工程等方面一直被广泛应用。将纳米金负载在不同的载体上可形成一系列新型的纳米金催化剂，从而可用于不同的催化体系。同时，纳米金由于其生物相容性，已广泛应用到生物传感器的研究开发中，而在生物传感器的发展改进过程中，主要工作集中在提高信号灵敏度，降低检测下限方面上。目前，纳米金作为催化剂应用到生物传感器上使用效率仍然较低。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供一种纳米金复合材料免疫传感器的制备方法，本发明方法制备的免疫传感器是利用纳米金颗粒在对硝基苯酚还原成为对氨基苯酚的过程中具有良好的催化还原能力，还原过程中会产生颜色的变化，通过对硝基苯酚的紫外/可见吸收变化进行测定。
[0004]本发明还提供了上述免疫传感器应用。
[0005]本发明纳米金复合材料免疫传感器的制备方法，包括以下步骤:
(1)制备氨基化的Fe3O4纳米磁珠
将直径为200?250nm的Fe3O4纳米磁珠分散到水中，Fe 304纳米磁珠浓度为0.2?
0.8mg/mL水,然后按浓度为0.1?0.4 μ L/mL水加入3_氨丙基三乙氧基娃烧,混合均勻，于15?25°C搅拌3?12h，得到氨基化的Fe3O4纳米磁珠；
(2)制备中空聚多巴胺-金纳米材料(PDA-Au)
a)将直径为200?250nm的Fe3O4纳米磁珠加入到pH为8.5的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲溶液中，配制成1.0?2.0mg/mL Fe3O4纳米磁珠的Tris分散液，然后加入多巴胺盐酸盐，Fe3O4纳米磁珠与多巴胺盐酸盐的质量比为1:0.8?1.2，混合均匀，于15?25°C搅拌反应3?24h，磁分离，得Fe3O4-聚多巴胺纳米颗粒；
b)将Fe3O4-聚多巴胺纳米颗粒配制成浓度为0.05?0.lmg/mL的溶液，然后加入质量分数为1%的氯金酸(HAuCl4)水溶液，Fe3O4-聚多巴胺与氯金酸(HAuCl4)水溶液的体积比为150?250:1，混合均匀，于80?100°C搅拌反应20?40 min，磁分离，得Fe3O4-聚多巴胺-Au纳米材料；
c)将Fe3O4-聚多巴胺-Au纳米材料配制成浓度为1.5?2.5mg/mL的溶液，加入浓度为5.5?6.5mol/L的盐酸水溶液1.5?2.5mL,于15?25°C搅拌反应5?8h，得中空聚多巴胺-纳米金材料；
(3)制备免疫传感器
a)将步骤(I)制备的氨基化的Fe3O4纳米磁珠分散到pH为7.2的Tris缓冲溶液中，配制成浓度为0.5?2.0mg/mL的分散液，按分散液与戊二醛水溶液的体积比0.5?2.0:1加入浓度为2.5wt%的戊二醛水溶液，于15?25°C搅拌反应3?12h，得到功能化Fe3O4纳米磁珠，将功能化Fe3O4纳米磁珠磁分离后重新分散到pH为7.2的Tris缓冲溶液中，配制成浓度为0.5?1.5mg/mL的分散液,加入浓度为2 μ g/mL的癌症标志物抗体,即一抗/Abl,功能化Fe3O4纳米磁珠分散液与一抗/Abl的体积比为5?20:1，37°C下震荡0.5?2h，随后加入浓度为lwt%的牛血清蛋白(BSA)用以封闭非特异性结合位点，功能化Fe3O4纳米磁珠分散液与加入的BSA的体积比为0.5?2:1，37°C下震荡10?60min后磁分离，随后加入pH为7.2的Tris缓冲溶液混合均匀，再次磁分离，将其重新分散到pH为7.2的Tris缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.5?2.0mg/mL的分散液，然后向上述分散液中加入质量浓度为lmg/mL的NaBH3CN水溶液，加入的NaBH3CN水溶液与上述分散液的体积比为0.5?2:1，然后于37°C震荡10?60min，得到Fe3O4-Abl ；
b)将上步得到的Fe3O4-Abl分散到pH为7.2的Tris缓冲溶液中配制成浓度为0.5?
1.5mg/mL的分散液，加入到从O U/mL到100 U/mL的不同浓度的癌症标志物的抗原(癌标)中，其中Fe3O4-Abl分散液与相对应的癌症标志物的抗原的体积比为0.5?2:1,37°C震荡10 ?60min,得至Ij Fe3O4-Abl-癌标；
c )将步骤(2 )制得的中空聚多巴胺-纳米金材料分散到pH为7.2的Tri s缓冲溶液中配制成浓度为0.5?2.0mg/mL的中空聚多巴胺-纳米金分散液，然后加入浓度为2 μ g/mL的癌症标志物抗体，即二抗/Ab2，中空聚多巴胺-纳米金分散液与二抗/Ab2的体积比为5?20:1，37°C下震荡0.5?2h，随后按中空聚多巴胺-纳米金分散液与BSA的体积比为0.5?2:1加入浓度为lwt%的BSA用以封闭非特异性结合位点，37°C下震荡10?60min，离心分离，将分离出的固体重新分散到PH为7.2的Tris缓冲溶液中，配制成浓度为0.5?2.0mg/mL的中空聚多巴胺-纳米金溶液，然后按中空聚多巴胺-纳米金分散液与Fe3O4-Abl-癌标的体积比为0.5?2:1加入浓度为0.5?2.0mg/mL的Fe3O4-Abl-癌标，于37°C下震荡10?60min后磁分离，随后加入10?20mLpH为7.2的Tris缓冲溶液混合均匀，再次磁分离，然后加入到对硝基苯酚和硼氢化钠混合水溶液中，得混合溶液，通过对溶液中对硝基苯酚紫外-可见光谱吸收的变化，即可实现癌症标志物抗原的检测。
[0006]所述的对硝基苯酚和硼氢化钠混合水溶液中，对硝基苯酚水溶液的摩尔浓度范围为0.05?0.2mmol/L,硼氢化钠水溶液浓度为0.1 mol/L,对硝基苯酚水溶液与硼氢化钠水溶液的体积比为0.5?2:1。
[0007]本发明方法所述Tris缓冲溶液的浓度为8?12mmol/L。
[0008]本发明制备得到的纳米金复合材料免疫传感器免疫检测线性范围为O?10U/mL，检测下限达0.05U/mL，相关系数达0.998。
[0009]本发明制备方法中，中空型聚多巴胺-纳米金复合材料的催化活性组分Au具有纳米尺度，并且高度、均匀分散于中空聚多巴胺球表面，使该材料作为催化剂时具有良好的活性；中空聚多巴胺球表层具有还原性，将HAuCl4还原为金纳米颗粒均匀分布在材料表面，提高了金纳米催化剂的利用率。进一步的，材料在除去内核模板Fe3O4后，重量降低，材料整体上水溶性较好，不易沉淀。
[0010]本发明制备得到的纳米金复合材料免疫传感器应用原理为:金纳米颗粒在对硝基苯酚还原成对氨基苯酚过程中具有良好的催化还原能力，还原过程中产生颜色的变化和对硝基苯酚的紫外/可见吸收变化跟待检测物质的浓度线性相关。随着待检测物质加入量的增加，进入免疫体系的与二抗相连的PDA-Au的量也随之增加。在硼氢化钠的存在下，实验测定不同时间点下，不同浓度待检测物质所对应的对硝基苯酚紫外/可见吸收的变化。
[0011 ] 本发明上述纳米金复合材料免疫传感器应用，主要用于检测癌症标志物抗原或者具有特异性结合特点的特征蛋白质。
[0012]检测时，将氨基化的Fe3O4纳米磁珠分散到Tris缓冲溶液中与癌症标志物抗体(Abl)相连后作为易分离的免疫探针；中空聚多巴胺-金纳米材料(PDA-Au)分散到Tris缓冲溶液中与癌症标志物抗体(Ab2)相连作为免疫识别物质。Abl与Ab2与对应癌症标志抗原特异性结合构成三明治夹心免疫体系。通过磁性将该免疫体系分离出来，随后加入到对硝基苯酚与硼氢化钠的混合水溶液中，PDA-Au中的金纳米可以催化还原对硝基苯酚为对氨基苯酚，在催化还原过程中产生紫外的变化可以通过紫外可见仪进行测定。随着癌症标志物抗原的量的增大，最终构成三明治夹心免疫体系的PDA-Au的量也随之增大，在进行紫外测定时，金纳米还原对硝基苯酹为对氨基苯酹的能力增大，测定结果中对硝基苯酹的信号减弱。在本发明中癌症标志物抗原的检测范围为0-100 U/mL，通过上述方法可得到良好的线性结果，线性方程为y = -0.01432 + 1.3745 C圖示](U/mL)，检测下限达0.05 U/mL，相关系数为0.998。
[0013]与现有技术相比，本发明纳米金复合材料免疫传感器的制备方法及应用的优点在于:
I)中空型聚多巴胺-纳米金复合材料，利用了 Fe3O4-聚多巴胺纳米颗粒形成的基质使纳米金吸附在壳核结构表面。多巴胺可在纳米磁珠表面自聚成膜，利用本身的还原性还原HAuCl4以形成金纳米颗粒,纳米金分布在Fe 304_聚多巴胺纳米颗粒复合材料表层,酸洗去除Fe3O4纳米磁珠后，催化性能保持不变，并且材料的水溶性得到提高，更有利于实际应用。
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